针灸通过调节大鼠前额叶皮层中的Glu–mGluR3–BDNF信号通路来减轻抑郁样行为

《Behavioural Brain Research》：Acupuncture Attenuates Depression-Like Behavior by Modulating the Glu–mGluR3–BDNF Signaling Pathway in the Prefrontal Cortex of Rats

　　孟丽|周然友|曾景宇|李景轩|李建国|严思敏|穆罕默德·沙赫扎德·阿斯兰|李鹏|沈俊良|刘思雨|宁莲莲|方慧|黄淑琼|陈凯莉|郝崇耀|孟显军
中国厦门大学医学院厦门大学翔安医院中医科

**摘要**
**目的**：本研究探讨针灸是否能够缓解CUMS模型大鼠的抑郁样行为，并研究Glu/mGluR3/BDNF信号通路是否与这些效应相关，旨在确定mGluR3为潜在的分子靶点而非确定的因果中介。
**方法**：雄性Sprague-Dawley大鼠被随机分为五组：对照组、CUMS组、CUMS+FXT组、CUMS+AP组、CUMS+SAP组以及CUMS+RA组。采用CUMS方案诱导抑郁状态，通过OFT、FST、EPM和SPT等行为测试评估抑郁样行为。运用苏木精、伊红和尼氏染色法对前额叶皮层进行组织学观察，同时通过免疫荧光技术检测该区域星形胶质细胞的密度。分别采用Western blot和RT-PCR技术测定前额叶皮层中EAAT1、GAD67、GAD65、GIRK2、BDNF和mGluR3的蛋白及基因表达水平。
**结果**：经过28天的CUMS处理后，CUMS组大鼠的体重显著低于对照组。干预21天后，与CUMS组相比，针灸显著提高了大鼠对蔗糖的偏好度，增加了OFT实验中的中心区停留时间，减少了FST实验中的静止时间。在分子层面，针灸显著上调了EAAT1、GABA和BDNF的表达，同时降低了GAD65、GAD67、Glu和mGluR3的水平。值得注意的是，在假针灸组和mGluR3拮抗剂组中，这些有益效应明显减弱。
**结论**：针灸可改善CUMS大鼠的核心抑郁样行为。这些治疗效果伴随着前额叶皮层中星形胶质细胞活性的增强以及谷氨酸毒性的减轻，且与Glu–mGluR3–BDNF信号通路的协同变化密切相关。在该通路中，mGluR3被认为是与针灸抗抑郁作用相关的潜在分子靶点；不过其因果作用及细胞类型特异性调控机制仍需未来研究进一步验证。

**1. 引言**
精神障碍是全球疾病负担的重要组成部分，其中抑郁症和焦虑症是全球最为常见的精神疾病。据预测，到2030年，抑郁症将成为全球最主要的疾病原因[59]。作为一种慢性情绪障碍，抑郁症不仅会给患者带来巨大的痛苦，还会带来沉重的经济负担。其主要症状包括持续性的抑郁或易怒情绪、冷漠、对正常甚至愉悦活动兴趣减退、社交能力下降、身体不适以及认知功能受损[48]。尽管已有大量长期研究，但抑郁症的发病机制仍未完全明确。研究表明，慢性重度抑郁症患者存在显著的神经结构和功能异常[62]、[64]，尤其是前额叶皮层区域。在该区域，神经元变化表现为突触丢失、树突结构简化以及细胞内能量平衡失调，最终导致突触传递功能受损[54]。前额叶皮层接收来自各种皮层下结构的兴奋性输入，其中包括丘脑核团——这一相对较少被研究的皮层下区域，已知它向前额叶皮层提供最密集的谷氨酸能投射[2]、[53]、[76]。前额叶皮层复杂的皮层-皮层及皮层-皮层下连接结构使其极易受到环境因素引发的机能障碍影响(Y. J. [74])。慢性压力主要影响负责认知和情绪调节的关键皮层区域——前额叶皮层，该区域的机能障碍与抑郁样行为密切相关。现有研究认为，抑郁症状态下前额叶皮层的机能障碍主要是由于患者星形胶质细胞活性降低所致[22]。因此，阐明导致这些结构变化的分子机制可能为抑郁症的治疗提供新的策略。在分子层面，糖皮质激素应激激素及其相关信号通路会促进突触退化[6]。最新证据表明，慢性压力会导致脑源性神经营养因子表达下调，同时损害前额叶皮层中由BDNF激活的信号通路。这些因素共同加剧了压力引发的树突棘密度及树突结构复杂度下降[([20]; S. [40], [63])]。

针灸作为中医中的重要治疗手段，经过数千年的实践验证，具有治疗抑郁症的疗效。越来越多的临床前和临床研究支持针灸作为一种非药物疗法，可用于治疗多种类型的抑郁症，包括抑郁相关性失眠[28]、产后抑郁症[F. Y. [82]]以及围绝经期抑郁症[H. [73]]。这种神经调节技术通过将细金属针插入特定的体表穴位，来调节气血在特定神经内分泌途径中的流动[J. G. [41]]。星形胶质细胞在BDNF的摄取、运输和分泌过程中起着关键作用，是神经营养调节三重机制中的重要组成部分。近期基于示踪剂的研究表明，星形胶质细胞会主动摄取BDNF，并通过囊泡运输机制将其定向重新分布，随后在突触微结构处进行旁分泌释放[([50]; J. [83])]。研究表明，针灸可通过调节星形胶质细胞的囊泡动态，增强依赖活动的BDNF外排，从而缓解抑郁症相关的行为症状[65]。其他作用机制还包括对单胺能系统（如血清素和多巴胺）的神经调节、改善脑部微循环、降低下丘脑-垂体-肾上腺轴的过度活跃，以及通过调节细胞因子谱发挥免疫调节作用(Y. [13]; J. [38]; B. [77])。尽管临床前研究已证明针灸在啮齿动物模型中具有抗抑郁作用，但这些神经可塑性变化背后的具体分子通路尚未完全明确。最新的神经化学研究表明，前额叶皮层中γ-氨基丁酸和谷氨酸的稳态失衡是抑郁症的病理生理基础[70]。GABA是哺乳动物中枢神经系统中的主要抑制性神经递质，它通过氯离子流动介导的超极化作用调节皮层兴奋性，从而维持情感调节所需的抑制-兴奋平衡。临床和临床前证据均表明，GABA能功能低下会扰乱前额叶皮层的网络动态，导致睡眠结构异常、认知灵活性下降以及快感缺失行为，这些都是抑郁症的核心特征[84]。谷氨酸则是中枢神经系统及外周器官系统中主要的兴奋性神经递质，具有动态的神经调节功能[49]、[5]、[75]。近期研究显示，多种精神疾病患者的谷氨酸浓度存在异常，光谱分析可发现不同区域的浓度变化模式[33]。重要的是，谷氨酸通过NMDA/AMPA受体介导的离子通道信号传导，调控自发的节律性神经元活动，同时还能通过代谢调节方式影响丘脑-皮层振荡，从而调控睡眠-觉醒转换[46]。谷氨酸能神经元的激活会引发觉醒反应，干扰睡眠连续性[51]。在突触传递过程中，神经元释放的谷氨酸会被星形胶质细胞吸收，通过星形胶质细胞谷氨酰胺合成酶的作用转化为谷氨酰胺，或通过三羧酸循环被氧化。生成的谷氨酰胺会被转运回神经元，重新合成谷氨酸，从而形成维持神经递质稳态的谷氨酸-谷氨酰胺循环[60]。另一种代谢途径是谷氨酸在谷氨酸脱羧酶的作用下脱羧生成GABA，即主要的抑制性神经递质[9]。星形胶质细胞产生的谷氨酰胺在兴奋性（谷氨酸能）和抑制性（GABA能）神经递质的再循环过程中起着关键的氮供体作用，从而维持大脑兴奋与抑制之间的平衡[81]。

《灵枢》作为中医经典著作，指出督脉在解剖结构和功能上都与中枢神经系统密切相关。近年来，神经影像学和临床试验的最新进展进一步证实了督脉在调节皮层网络动态方面的治疗潜力，尤其有助于缓解情绪不稳定和认知紊乱。这使督脉成为治疗抑郁症等神经精神疾病的潜在辅助靶点。关于穴位选择机制的研究表明，在抗抑郁干预过程中，上额穴（GV23）和小脑-丘脑投射区（GV16）会被优先激活[14]。然而，这种治疗效应背后的精确神经生物学机制尚不明确。本研究旨在阐明针灸的抗抑郁作用是否是通过调节前额叶皮层网络中的星形胶质细胞功能实现的。在我们的研究设计中，我们选择了督脉上的GV23和GV16两个穴位，因为它们具有明确的神经调节作用(Y. [12])。因此，这两个穴位被选为在本实验框架内实施抗抑郁干预的靶点。我们认为，前额叶皮层中观察到的星形胶质细胞激活与针灸在CUMS大鼠模型中的神经调节作用密切相关。这种关联可能反映了星形胶质细胞对谷氨酸能稳态的调节作用，以及其对皮质边缘系统突触可塑性的促进作用。

**2. 材料与方法**
**2.1 实验动物**
本研究中，84只SPF级Sprague-Dawley大鼠（体重80-110克）购自北京维塔河实验动物技术有限公司，随后在厦门大学动物实验中心适应一周。大鼠被置于标准饲养条件下饲养（12小时光照/黑暗周期，温度23±2℃，湿度60±5%），可自由获取食物和水。本实验遵循中国实验动物科学协会2018年发布的指南，并获得了厦门大学动物伦理委员会的批准（批准号：XMULAC202110062）。我们在实验过程中尽量减少对大鼠的伤害，严格遵守伦理规范。

**2.2 实验设计与建模流程**
适应一周后，首先对大鼠进行称重，并进行蔗糖偏好测试。根据这些基线数据，选取66只体重和蔗糖偏好值相近的大鼠，通过随机数表将其随机分配到六组，每组11只：对照组（CON）、慢性不可预测轻度应激模型组（CUMS）、氟西汀干预组（CUMS+FXT）、针灸干预组（CUMS+AP）、假针灸干预组（CUMS+SAP）以及激动剂干预组（CUMS+RA）。图1.A展示了实验流程图。对照组大鼠在7天内自由进食饮水，不进行任何模型构建或干预。CUMS组大鼠每天接受49天的CUMS应激处理。CUMS+FXT组大鼠同样每天接受49天的CUMS应激处理，但从第29天开始给予氟西汀灌胃。氟西汀溶液提前24小时配制，浓度为0.21毫克/毫升，干预开始前1小时以10毫克/公斤的剂量给予，共持续21天[15]。CUMS+AP组大鼠也每天接受49天的CUMS应激处理，但从第29天开始进行针灸干预。大鼠在应激处理前1小时被固定，然后用直径0.25毫米、长度13毫米的针在GV23和GV16穴位进行每日针灸治疗，共持续21天[4]。CUMS+SAP组大鼠同样每天接受49天的CUMS应激处理，之后继续进行21天的假针灸干预。从第29天起，也在GV23和GV16穴位进行每日假针灸治疗，使用的针具同样为直径0.25毫米、长度13毫米的浅表针。CUMS+RA组大鼠同样每天接受49天的CUMS应激处理，从第29天开始每天进行针灸治疗，并腹腔注射LY404039。激动剂的剂量为3毫克/公斤，浓度为0.3毫克/毫升，针灸结束后30分钟以10毫克/公斤的剂量注射[61]。给大鼠固定头部向下，暴露腹部以便注射。在距离腹部中线2厘米处的皮肤消毒后，以45度角插入针头。确认针头周围没有血液、肠道内容物或气体后，缓慢注入溶液。

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图1. 实验方案示意图及大鼠体重测量情况。(A) 实验流程图。(B) 第0天大鼠的体重。(C) 21天干预后的体重变化曲线。(D) CUMS处理后的蔗糖偏好率。(E) 干预期间六组大鼠的体重变化情况。数据以均值±标准误表示，每组11只大鼠。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001表示各组间存在显著差异。统计分析采用单因素方差分析，随后进行Tukey事后检验（B），或双因素重复测量方差分析（C,D）。

**2.3 CUMS应激模型建立方法**
本研究采用CUMS方法建立大鼠抑郁模型，该方法能够诱发类似人类抑郁症的厌世和绝望行为[14]，可有效模拟人类慢性压力的不可预测性。本实验共使用了11种不同的应激方法，包括：(1)24小时断食，(2)24小时断水，(3)24小时潮湿垫料，(4)24小时无垫料，(5)尾部夹痛3分钟，(6)24小时闪烁灯光，(7)昼夜周期颠倒，(8)每笼5只大鼠的拥挤环境，(9)酒精刺激，(10)10次电击足部，(11)3小时束缚。每周随机选择两种不同的应激方法，持续7周，确保同一应激方法不会在连续3天内重复使用。

**2.4 行为测试**
为了评估大鼠的抑郁样行为，实验期间每周都会监测大鼠的体重。行为评估包括蔗糖偏好测试、开放场试验、升高平台迷宫试验以及强迫游泳试验。

**2.4.1**蔗糖偏好测试（SPT）：该测试通过测量啮齿动物对糖水的偏好度下降情况来检测其快感缺失症状，这一天然倾向可用于研究抑郁症。快感缺失指的是无法从愉悦活动中获得快乐感。测试包括适应期和正式测试期[37]。在两天的适应期内，大鼠可自由饮用两瓶浓度为1%的蔗糖溶液，时间为24小时。之后其中一瓶被换成纯水，且两瓶的位置每12小时更换一次，以避免位置偏见。经过24小时的禁食后进入测试期，此时再次提供这两种溶液，且在中途交换位置以确保结果准确性。测试开始时，每只大鼠面前会放置两个外观相同的瓶子：一个装纯水，另一个含1%蔗糖溶液。大鼠可自行选择饮用哪种液体。实验结束后，统计每只大鼠对纯水和蔗糖溶液的摄入量，进而计算出蔗糖偏好率。其计算公式为：SPT（%）= [蔗糖溶液摄入量 / （蔗糖溶液摄入量 + 纯水摄入量）] × 100%。

2.4.2 开放场地测试（OFT）：啮齿动物通常会对大型、明亮且开放的不熟悉环境表现出强烈的恐惧和回避行为。进入这类环境后，它们往往只在边缘活动，很少在中央区域活动。因此，OFT用于记录大鼠在新型开放环境中的各种行为数据，包括自发活动、探索行为以及重复性刻板行为。这些数据可用于评估大鼠的自发活动水平以及类似焦虑和抑郁的行为[29]。鉴于大鼠对光源极为敏感，实验在控制良好的光照条件下进行，以减少强光照射。实验装置上方1.5米处放置一个软光箱，确保光线强度为100勒克斯且均匀柔和。测试环境保持安静，噪音水平不超过30分贝，以避免听觉干扰。实验前15分钟让大鼠适应测试环境，实验本身持续5分钟。实验装置为一个100厘米×100厘米×40厘米的正方形黑色开放场地，中央上方装有红外摄像头，用于监测大鼠的活动轨迹。德国Smart 3.0软件用于记录大鼠在中央区域停留的时间及总移动距离。实验结束后，研究人员还会记录大鼠产生的粪便颗粒数量。为避免不同试验之间相互污染，每次实验后都会彻底清洁开放场地装置，用75%酒精清除残留的粪便，以去除上一只大鼠留下的信息素。

2.4.3 高架十字迷宫测试（EPM）：EPM是一种趋避冲突测试。由于啮齿动物天生更喜欢黑暗、回避光线，它们往往会停留在光线较暗的封闭通道中[71]。高架十字迷宫由两个开放通道（50厘米×10厘米）、两个封闭通道（50厘米×10厘米×40厘米）以及一个中央区域（10厘米×10厘米）组成，整个装置距离地面约80厘米。开放通道没有侧壁保护，模拟“危险环境”，能引发实验动物对高度的恐惧以及在开阔空间的焦虑感；而封闭通道虽有高侧壁提供安全感，但缺乏新奇刺激。不过，动物天生的好奇心会驱使它们去探索开放通道。但由于高架十字迷宫离地面很高，当动物进入开放通道时，会因恐高而产生类似焦虑的情绪。因此，我们利用EPM来评估动物的焦虑和抑郁样行为。实验期间，测试环境保持安静，噪音水平不超过30分贝，以避免噪声干扰。光线强度控制在100勒克斯，防止动物直接暴露在强光下。实验前15分钟将大鼠放入测试环境让其适应，实验时长为5分钟。实验装置中央上方装有红外摄像头，用于追踪大鼠的活动轨迹。德国Smart 3.0软件用于记录并分析大鼠在开放通道中停留的时间比例及总移动距离。每次测试后，都会彻底清洁开放场地装置，用75%酒精擦拭装置内的粪便，去除上一只大鼠留下的信息素，避免影响下一只大鼠。

2.4.4 强制游泳测试（FST）：FST是一种旨在评估行为绝望感的实验方法，其依据是大鼠天生厌恶水环境[79]。通过将大鼠置于无法逃脱的封闭水域中，该测试可诱发不可避免的心理压力状态。因此，FST被用作评估不同实验组大鼠绝望样行为的标准化方法。实验过程中，大鼠被放入直径0.2米、高度0.45米的透明量筒中，量筒内注水深度约为0.3米。水温维持在23±1摄氏度，环境噪音水平控制在55至70分贝之间，室温同样保持在23±1摄氏度。整个测试持续6分钟，其中包括2分钟的适应时间。随后4分钟内，红外摄像头会记录大鼠的静止状态，德国Smart 3.0软件则用于分析大鼠保持静止的时间占比。测试结束后，立即用吸水毛巾轻轻擦干大鼠，并将其放回原笼。每次实验都使用新鲜水，为保证实验准确性，水会定期更换。

2.5 样本采集：完成行为评估后，大鼠需禁食24小时，但可自由饮水。采取这一措施是为了降低麻醉过程中胃内容物反流导致死亡的风险。首先通过腹腔注射3%戊巴比妥钠，剂量为3毫升/千克，以达到深度麻醉状态。随后在冰盘上对大脑进行精细解剖提取，立即将其浸入低温生理盐水中。前额叶皮层组织则迅速用液氮冷冻，以备后续分析使用。在用0.9%生理盐水和4%多聚甲醛处理后，取出脑组织，再将其在多聚甲醛溶液中固定24小时。

2.6 酶联免疫吸附测定（ELISA）：按照制造商的说明，使用ELISA试剂盒检测各组大鼠前额叶皮层中Glu、K+和GABA的含量。通过微孔板读数仪在340纳米、640纳米和450纳米波长处测量光密度，再根据标准曲线计算出相应含量。

2.7 尼斯尔染色：新鲜的前额叶皮层组织样本先在4%多聚甲醛中固定，然后通过逐步升高的乙醇系列（70%、85%、95%和100%）进行脱水处理，接着用环保型脱蜡液（脱蜡液Ⅰ和Ⅱ，各20分钟）进行脱蜡。脱蜡后的组织需用熔化的石蜡浸润三次（每次约1小时），并以冠状面与包埋模具底部平行的方式将其包埋。石蜡块固化后，切取连续切片。切片先用环保型脱蜡液Ⅰ和Ⅱ脱蜡（各20分钟），再通过逐渐降低浓度的乙醇系列（100%、95%、70%）直至蒸馏水进行复水处理，最后用甲酚紫染色2至5分钟。在蒸馏水中短暂冲洗后，再用0.1%冰醋酸进行分化处理。分化完成后用自来水冲洗，通过显微镜观察分化的程度。切片经烘箱干燥后，用二甲苯脱蜡10分钟，最后用中性树脂封片。在200倍放大倍数下观察前额叶皮层的组织学变化。每只大鼠选取四个互不重叠的区域，评估神经元膜完整性、细胞核形态以及整体结构保存情况。这些目标区域使用CaseViewer 2.4软件在200倍倍数下成像，所得图像则用Image-Pro Plus 6.0软件进行分析。经过空间校准到毫米精度后，可测量每个切片中的神经元数量及对应组织面积，进而计算出神经元密度，单位为神经元/平方毫米。

2.8 苏木精-伊红染色：切片平衡处理后，先在高清苏木精预处理液中浸泡1分钟，然后再用苏木精染色3至5分钟，随后进行分化处理、蓝色染色和冲洗。在95%乙醇中脱水1分钟后，用伊红进行反染15秒。染色后的切片需用无水乙醇脱水三次（每次2分钟），再用正丁醇和二甲苯分别脱水两次（每次2分钟），最后用中性树脂封片。形态学观察使用尼康自动显微镜（日本尼康公司生产）进行。

2.9 免疫荧光染色：脱蜡后的切片在pH值为6.0的柠檬酸盐缓冲液中进行抗原回收处理，自然冷却后，在去色摇床上用pH值为7.4的PBS清洗。按指定比例稀释后的一抗加入切片中，然后在湿度控制的培养箱中于4摄氏度下孵育过夜。之后加入与物种匹配的二抗，在室温下孵育50分钟，最后用DAPI对细胞核进行反染，时间为10分钟，且在黑暗环境中进行。切片用抗褪色介质封片，随后用荧光显微镜或载玻片扫描仪进行成像。GFAP的表达量通过ImageJ软件及标准阈值处理方法进行定量分析。

2.10 蛋白印迹分析（WB）：约20毫克的前额叶皮层组织在含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的200微升RIPA裂解缓冲液中，使用组织匀浆器匀浆4分钟。得到的匀浆液在冰上放置30分钟，然后在4摄氏度下以12,000转/分钟的速度离心20分钟。收集上清液后，用BCA试剂检测蛋白质浓度。对于每个样本，取30微克蛋白质与5倍上样缓冲液混合，置于100摄氏度下煮沸10分钟，随后以10,000转/分钟的速度离心10分钟。根据蛋白质的分子量，通过10% SDS-PAGE进行分离。之后将蛋白质电泳转移至PVDF膜上。这些膜在室温下用5%脱脂牛奶在TBST溶液中封闭1小时，随后在4摄氏度下与下表中列出的相应一抗共同孵育过夜。

2.11 反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）：需获取约20毫克的前额叶皮层组织，然后按照制造商的方案，加入200微升Trizol试剂（美国Invitrogen公司生产）提取总RNA。需用NanoDrop光谱仪（美国赛默飞世尔科技公司产品）检测提取RNA的纯度和浓度，确保A260/A280比值在1.8到2.0之间。之后使用TaKaRa公司的PrimeScript RT试剂盒进行反转录，合成互补DNA（cDNA）。反转录的反应条件为37摄氏度下反应15分钟，之后在85摄氏度下反应5秒，使酶失活。合成的cDNA将作为PCR扩增的模板，扩增在实时定量PCR仪器（美国Bio-Rad公司产品）上进行，所用试剂为SYBR Green PCR Master Mix（美国应用生物系统公司产品）。引物序列详见表1，β-actin作为内部参考基因。

表1 PCR检测用引物信息
目标基因名称 引物序列（5'-3'）
空白 大鼠-β-actin-F CTGGCTCCTAGCACCATGAA
180 大鼠-β-actin-R AAACGCAGCTCAGTAACAGT
大鼠-Kcnj6（Kir3.2） FCCTCCATCAGAGCCAAGT 127
大鼠-Kcnj6（Kir3.2） RAGCGGTGACACGAGAAA 大鼠-GAD67 FGCAGGCACGACTGTTTAT 164
大鼠-GAD67-R AAAT1ACTGAATTGGCCCTTTC 大鼠-GAD65 FCACTGCCAAACAACTCTAA 105
大鼠-GAD65-R CAAACCAATCTGCTGCTA 大鼠-Slc1a3（EAAT1） FTGATCGGAAACATGAAGG 117
大鼠-Slc1a3（EAAT1） RAGAGGATGCCCAGAGGTG 2.12 统计分析：WB和RT-PCR的图像通过ImageJ软件进行灰度量化处理，所有目标蛋白或基因的表达数据均以相应的内部对照值进行归一化处理。不同实验之间的数据归一化是通过将各组的数值相对于其对应的对照组来表示的。所有数据均以均值±标准误的形式呈现。对于体重等随时间变化的纵向数据，采用双因素重复测量方差分析，其中组别为组间因素，时间为组内因素。当检测到显著的组别×时间交互作用时，通过Bonferroni校正后的成对比较方法来分析各个主效应。对于非纵向数据，则采用单因素方差分析比较各组均值，若出现统计学上显著的整体差异，则进一步使用Tukey诚实显著差异检验进行成对比较。当同时分析多个独立的结局变量时，会通过Bonferroni校正进一步调整显著性水平，以控制各结局间的家族错误率。在进行参数检验之前，分别使用Shapiro–Wilk检验和Levene检验来验证正态性假设和方差齐性假设。所有数据均使用GraphPad Prism[版本10.0.2，GraphPad Software Inc.，美国加利福尼亚州圣地亚哥]软件进行绘制和分析。P值小于0.05且为双尾检验结果时，视为具有统计学显著性。

3. 结果
3.1. 针灸可减轻CUMS诱导的抑郁样行为
行为评估包括监测体重，以及进行食欲与快感缺失评估的SPT测试、探索行为与焦虑样行为评估的OFT测试、焦虑程度评估的EPM测试，以及抑郁程度评估的FST测试。图1B显示，在进行CUMS建模之前，各组之间的体重没有差异。经过28天的CUMS处理后，各组的体重显著低于对照组（***P < 0.001）。在干预21天后（图1C），不同时间点各组的体重变化存在显著差异。与CUMS组相比，针灸组和氟西汀组在35天、42天和49天的体重均有显著上升（图1E）。经过28天的CUMS建模后，各组的蔗糖偏好指数低于对照组，表明存在抑郁样行为。干预后，CUMS+FXT组和CUMS+AP组的蔗糖偏好显著高于CUMS组，说明抑郁症状有所改善。然而，CUMS+SAP组和CUMS+RA组的蔗糖偏好则低于CUMS+AP组（图1D）。图2显示，与对照组相比，CUMS模型大鼠在EPM测试中的中心时间缩短，在OFT测试中的中心移动距离和停留时间减少，而在FST测试中的静止时间增加（***P < 0.001）。与CUMS组相比，针灸和氟西汀治疗均能改善这些行为表现（**P < 0.01）。不过，CUMS+RA组的表现比CUMS+AP组更差（*P < 0.05）。
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图2. 行为测试。(A) 上升式迷宫轨迹图。(B) 开放场地测试轨迹图。(C) EPM测试中在开放区域的时间。(D) FST测试中的静止时间。(E) 开放场地测试中的中心移动距离。(F) 开放场地测试中的总移动距离。结果以均值±标准误表示，每组n=11。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001表示相应组间存在显著差异。统计分析采用单因素方差分析，随后进行Tukey事后检验。

3.2. 针灸可缓解CUMS引起的前额叶皮层的病理改变
形态学分析（图3A-B）显示存在严重的病理变化。HE染色结果显示，对照组神经元数量充足，染色均匀，细胞核呈圆形且较大，核仁清晰，毛细血管间隙较宽。而CUMS组神经元出现萎缩，体积减小，形态不规则，核质边界不清，偶尔还会出现细胞质淡染的肿胀现象。不过，CUMS+AP组和CUMS+FXT组的神经元状况有明显改善，几乎无肿胀现象，核质染色也保持均匀。Nissl染色用于观察前额叶皮层神经元的形态，结果显示对照组神经元密集，细胞核位于中央。相比之下，CUMS模型大鼠的神经元出现萎缩，细胞质浓缩，神经元数量显著减少（**P < 0.01）。CUMS+FXT组和CUMS+AP组的神经元数量多于CUMS组（*P < 0.05，**P < 0.01）。与CUMS+AP组相比，CUMS+SAP组和CUMS+RA组的前额叶皮层神经元退化更为严重（*P < 0.05）。
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图3. 针灸可缓解CUMS引起的前额叶皮层的病理改变。(A) 前额叶皮层的HE染色和Nissl染色结果。(B) 前额叶皮层中Nissl染色的神经元密度。结果以均值±标准误表示，每组n=11。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001表示相应组间存在显著差异。统计分析采用单因素方差分析，随后进行Tukey事后检验。

3.3. 针灸与mGluR3激活可调节Glu-mGluR3-BDNF信号通路中的神经递质水平及蛋白表达
如图4所示，RT-PCR分析发现，CUMS模型大鼠的GAD65和GAD67 mRNA水平显著升高，而EAAT1的表达则降低（**P < 0.01，***P < 0.001）。在CUMS+FXT组和CUMS+AP组中，这些变化得到了逆转（**P < 0.01）。不过，CUMS+RA组在一定程度上削弱了针灸的治疗效果（*P < 0.05）。
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图4. 针灸对CUMS模型大鼠前额叶皮层中EAAT1及Glu-mGluR3-BDNF通路的影响。(A) EAAT1的代表性mRNA图像。(B) GAD65的代表性mRNA图像。(C) GAD67的代表性mRNA图像。(D) GIRK2的代表性mRNA图像。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001表示相应组间存在显著差异。统计分析采用单因素方差分析，随后进行Tukey事后检验。Western blotting检测（图5 A-F）证实，CUMS处理后蛋白水平也存在类似变化：EAAT1和BDNF表达下降，而mGluR3、GAD67和GAD65表达上升（**P < 0.01，***P < 0.001）。CUMS+FXT组和CUMS+AP组能够恢复EAAT1和BDNF的表达，同时抑制mGluR3、GAD65和GAD67的表达；而CUMS+RA组则干扰了GAD67的表达调控（*P < 0.05，**P < 0.01）。
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图5. 不同组大鼠前额叶皮层中与Glu-mGluR3-BDNF通路相关的蛋白及神经递质表达水平。(A) 通过Western blotting检测各组大鼠前额叶皮层中与Glu-mGluR3-BDNF通路相关的蛋白表达水平。(B) EAAT1蛋白水平的Western blot检测结果。(C-F) EAAT1、mGluR3、GAD65、GAD67、BDNF的相对表达水平。(G-I) Glu、GABA、K+的相对表达水平。结果以均值±标准误表示，每组n=3。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001表示相应组间存在显著差异。统计分析采用单因素方差分析，随后进行Tukey事后检验。通过比色法检测了对抑郁症发病具有重要意义的Glu、K+和GABA的水平（图5 G-I）。CUMS模型大鼠的Glu和K+水平较高，而GABA水平较低（*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001），而CUMS+FXT组和CUMS+AP组使这些指标恢复正常水平（*P < 0.05，**P < 0.01）。EAAT1、GAD65、GAD67、GIRK2和BDNF的mRNA及蛋白水平均存在显著差异。CUMS处理会升高GAD65、GAD67、GIRK2和mGluR3的水平，同时降低EAAT1和BDNF的水平。针灸和氟西汀能够逆转这些变化，而假针灸或受体激动剂仅能部分逆转这些变化。这些结果表明，针灸和mGluR3调控可能通过谷氨酸转运体影响Glu-mGluR3-BDNF通路。

3.4. 针灸与mGluR3激活对抑郁大鼠前额叶皮层星形胶质细胞活化的作用
星形胶质细胞的突起会包裹神经元胞体及树突，从而为神经元提供结构支持，隔离神经回路，维持神经元稳定性。本研究通过检测前额叶皮层中的胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫荧光强度来评估星形胶质细胞的活化程度。如图6A-C所示，CUMS组GFAP的表达显著降低（*P < 0.05），而CUMS+AP组和CUMS+FXT组的GFAP表达则显著升高（*P < 0.05）。不过，CUMS+RA组在一定程度上削弱了针灸的治疗效果（*P < 0.05）。这些研究结果表明，CUMS会减弱前额叶皮层星形胶质细胞的活化，而针灸和氟西汀干预则能恢复星形胶质细胞的反应性，这说明星形胶质细胞介导的机制可能参与了针灸的治疗作用。
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图6. AP对暴露于CUMS的大鼠前额叶皮层GFAP表达的影响。(A) 图像为免疫荧光染色结果（条形长度=50μm，n=3）。(B-C) 前额叶皮层中GFAP的表达水平。结果以均值±标准误表示，每组n=3。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001表示相应组间存在显著差异。统计分析采用单因素方差分析，随后进行Tukey事后检验。

4. 讨论
本研究利用CUMS方法成功建立了抑郁大鼠模型，从而证实了针灸在改善CUMS诱导的抑郁样行为及神经损伤方面的治疗效果。此外，本研究还探讨了作为潜在分子相关因子的mGluR3是否与Glu–mGluR3–BDNF信号通路存在关联。尽管该信号通路已被认为与多种精神障碍的病理过程有关，但其在抑郁症中的作用机制目前仍不完全清楚。本研究的发现为明确该信号通路的潜在作用提供了实验依据，但其因果功能还需进一步验证。作为一种成熟的抑郁样行为诱导模型，CUMS因其能够模拟人类慢性压力的不可控性，以及其核心症状（如快感缺失和行为绝望）与人类抑郁症症状的高度一致性，被广泛用于情绪障碍研究。一个值得注意的发现是，与对照组相比，CUMS组在OFT测试中的总活动距离显著减少，这一结果与最初假设的基线活动水平无变化相矛盾。在解读与焦虑和绝望相关的指标时，必须谨慎考虑这一差异。不过，OFT测试中活动减少是CUMS模型的典型特征，普遍被视为该模型的有效指标，而非单纯的干扰因素，这一特点与抑郁症患者出现的运动迟缓现象一致[26]。因此，针灸所导致的总活动距离恢复，可能本身就体现了其对抑郁样综合征中运动功能方面的积极影响。需要指出的是，并非所有的情绪相关指标都依赖于总活动距离。在上升式迷宫测试中，停留在开放区域的时间百分比（%OAT）是反映焦虑样行为的相对指标，且与进入开放区域的总次数相对独立。尽管两组动物的活动总量存在差异，但%OAT却因CUMS处理而显著降低，又因针灸处理而恢复，这一现象表明针灸确实对与焦虑相关的探索行为产生了影响。在强迫游泳测试中，CUMS组动物静止时间的增加并非由于整体运动能力下降；FST测试旨在诱发被动的应对策略，急性游泳压力下的静止状态反映的是行为绝望，而非运动功能障碍。针灸显著增加了动物的主动活动（如攀爬和游泳）行为，如果动物存在运动障碍，是不会出现这种表现的。这一现象表明，动物的动机系统和运动系统仍然基本完好，静止时间的差异是由于应激应对方式的不同所致。鉴于这些行为指标之间存在相互关联性，本研究的结果更应被理解为针灸改善了CUMS诱导的一系列情绪障碍——包括运动迟缓（OFT测试距离）、焦虑样行为（EPM测试的%OAT值）以及被动应激应对行为（FST测试的静止时间）——而非仅对某一特定方面产生作用。尤其需要注意的是，由于活动总量的差异，OFT测试中中心时间的变化应当谨慎解读。本研究采用了药物相互作用设计，比较了单独使用针灸与针灸联合使用mGluR3激动剂LY404039的效果，而非采用包含单独使用LY404039组的完全因子设计。选择这种设计是因为本研究的主要目的是检测针灸的治疗效果是否依赖于正常的mGluR3信号传导，而非探究LY404039在CUMS模型中的独立作用。这类药物阻断策略在初步的受体介导研究中已被广泛应用，可避免构建复杂的剂量-效应关系矩阵（Jianguo [39]）。本研究的关键发现是，针灸+LY404039组在多个指标上的表现均显著不同于单纯针灸组，这体现了二者之间存在直接的相互作用：针灸的益处因受体同时被激活而被削弱，这一现象表明，未经抑制的mGluR3信号传导是针灸发挥治疗作用的前提。这一结论不受LY404039的独立作用强度或方向的影响，因为它反映的是机制上的依赖关系，而非简单的叠加效应。这一解释还得到了药理学证据的支持。虽然目前尚无直接报道表明LY404039单独在CUMS模型中具有促抑郁作用，但相反的干预措施——选择性mGluR3拮抗或负向别构调节——在慢性应激模型中已被反复证明具有类似抗抑郁的作用[19]。阻断mGluR3信号传导具有抗抑郁作用这一原理意味着，外源性激活该受体可能会使系统向抑郁方向发展[30]，这一结论与我们观察到的LY404039联合使用会削弱针灸的保护作用相符。需要强调的是，当前的数据无法确定LY404039是具有独立的促抑郁作用，还是仅仅通过功能拮抗作用掩盖了针灸的疗效。因此，目前的解读仅限于针灸与mGluR3之间的相互作用，若要得出更广泛的药理学结论，就需要设置专门的研究组来检测LY404039单独的作用。CUMS的慢性且不可预测的特性会导致谷氨酸能系统的持续过度活跃，从而使mGluR3受到持续的、非生理性的过度刺激[56]。在这些条件下，II组mGluR受体的长期激活可引发受体脱敏，并使细胞内信号传导偏离具有保护作用的PI3K/Akt级联反应[1]。在CUMS模型中，这种慢性mGluR3过度激活无法上调BDNF水平，反而可能抑制突触修复所必需的、由mTOR驱动的突触蛋白合成，这一现象已在先前的研究中被证实[31][18]。反向翻译研究提供的有力证据表明，抑制而非激活mGluR3才能带来治疗效果[17]。对mGluR3的负向别构调节或基因敲低能迅速产生类似抗抑郁的效果[32]，并可逆转慢性压力导致的额叶皮层和海马体中的突触功能缺陷[30]。相比之下，使用正构激动剂直接药理激活mGluR3则无法缓解压力引起的行为绝望情绪，有时甚至会加剧这种情况[27]。mGluR3的一个显著特征是其作为突触前自受体的功能[16]。我们推测，在CUMS状态下，其病理性过度激活会过度抑制关键神经回路中的谷氨酸释放。这种谷氨酸能传递的抑制会触发突触后AMPA受体的稳态下调[32]，最终导致本研究及其他研究中所观察到的突触功能障碍[18]。因此，药理抑制mGluR3可解除对谷氨酸释放的抑制，恢复正常的信号传递，从而促进突触功能恢复——这一机制在CUMS状态下具有保护作用，但在健康状态下似乎并非必需[36]。这些发现进一步证实，mGluR3是针灸发挥抗抑郁作用的关键靶点。额叶皮层在调控情绪和社会行为中起着核心作用。BDNF是一种对大脑功能和行为调节至关重要的蛋白质，它在额叶皮层、海马体及杏仁核等区域发挥作用[80]。大量研究表明，BDNF-mTOR通路与抑郁症的病理机制以及抗抑郁药物的治疗效果密切相关[F. [10]; P. [78)]。本研究发现，针灸和氟西汀干预均可通过上调EAAT1和BDNF的表达，同时在不同程度上下调CUMS大鼠额叶皮层中mGluR3和GIRK2的表达。此外，mGluR3能够与EAAT1的细胞内结构域结合，从而抑制其膜转运功能，进而减少BDNF的分泌。这与先前关于BDNF通过TrkB受体增强记忆和认知功能的发现相呼应[69]。谷氨酸是中枢神经系统内主要的兴奋性神经递质，其在突触传递之外的功能也极为重要。其突触外储备不仅对神经元和星形胶质细胞的代谢功能至关重要，还有助于促进这两种细胞类型之间的功能协作[25][69]。这是通过调节葡萄糖的摄取差异来实现的，使得谷氨酸成为神经元与星形胶质细胞相互作用中的核心信号分子。被星形胶质细胞摄取后，突触外的谷氨酸可作为合成谷氨酰胺的前体，或被星形胶质细胞和神经元进行代谢处理。此外，细胞外谷氨酸还能增强星形胶质细胞的葡萄糖摄取，同时抑制神经元的葡萄糖摄取。因此，谷氨酸在中央神经元与星形胶质细胞之间的相互作用中起着关键中介作用，其释放和转运的调控反映了这些细胞之间的协同功能。谷氨酸稳态和神经递质传递的紊乱被认为是抑郁症和焦虑症发病的重要因素[3][85]。在本研究使用的CUMS动物模型中，长期压力会提高谷氨酸能神经元的兴奋性，同时减少星形胶质细胞的数量、GFAP的表达以及突触可塑性。需要强调的是，GFAP是星形胶质细胞反应性的通用标志物，无法区分神经毒性（A1）型与神经保护性（A2）型的星形胶质细胞。因此，GFAP表达的增加表明星形胶质细胞的反应性发生了改变，但本研究中并未确定具体的极化状态。基于EAAT1和BDNF的同时上调——这两种分子都与神经保护性星形胶质细胞功能相关——可以推测星形胶质细胞可能向具有神经支持作用的表型转变。在抑郁症模型中，恢复星形胶质细胞的谷氨酸转运蛋白和神经营养因子的分泌与一种非炎症性的支持性反应状态相关[57]，也有研究指出某些非药物干预措施能使星形胶质细胞避免出现促炎性反应特征[S.-S. [42]]。这些协同的分子变化为这一假设提供了间接依据，但还需要通过A1/A2特异性标志物进行直接验证。因此，目前的研究结果仅能表明星形胶质细胞反应性发生了改变，关于表型极化的任何推断都仍属推测，需未来进一步研究。这些变化会导致额叶皮层出现病理性损伤，表现为神经元萎缩和核质边界模糊，最终引发类似抑郁的行为。作为谷氨酸能神经递质传递的关键调节者，星形胶质细胞具有广泛的神经递质调控功能，在调节谷氨酸兴奋性方面起着核心作用[J. [43]]。当神经元从囊泡中释放大量谷氨酸时，星形胶质细胞膜上的谷氨酸转运蛋白（兴奋性氨基酸转运蛋白，EAATs）是清除突触间隙中过量谷氨酸的主要机制。在各种机制中，EAAT1通过高效转运细胞外谷氨酸，在维持神经元周围的谷氨酸稳态方面发挥着关键作用。这一过程可防止因谷氨酸过度积累而引发的兴奋毒性，从而保障神经元的正常功能[Y. [45], [52]]。在经典的谷氨酸-谷氨酰胺循环中，星形胶质细胞和神经元共同将谷氨酸转化为非兴奋性的谷氨酰胺[67]，后者随后被神经元重新吸收用于合成谷氨酸[L. [44]]。这凸显了星形胶质细胞在减轻神经元谷氨酸毒性方面的不可或缺作用。我们认识到，此处通过Western blotting和ELISA测定的总EAAT1蛋白水平并不能直接反映血浆膜上功能性转运蛋白的表达情况。尽管如此，越来越多的证据表明，在慢性压力和抑郁症背景下，星形胶质细胞中谷氨酸转运蛋白总量的变化可能具有功能性意义。慢性压力模型通常会降低总GLT-1/EAAT1以及膜结合型的GLT-1/EAAT1水平，而多种抗抑郁方法——无论是药物还是非药物干预——都能同时上调总EAAT1水平，进而改善谷氨酸的清除效率[7]; J.-x. [11]]。与我们研究相关的是，已有报道指出针灸能够逆转压力引起的星形胶质细胞谷氨酸转运蛋白表达下降，并恢复细胞外谷氨酸水平[S.-S. [42]]，这说明即便只有总蛋白数据，也能为功能恢复的可能性提供支撑。在本研究中，两种独立方法均检测到一致的上调趋势，进一步增强了我们对所观察到的分子调控结果的信心。不过，由于缺乏直接的膜定位检测，我们的解释仅限于“总EAAT1蛋白水平的上调，这可能意味着谷氨酸转运能力有所提升”。我们还需承认一个局限性，即此处仅检测了EAAT1的总蛋白水平；并未进行亚细胞分级或表面生物素标记，且剩余样本量有限，无法进行进一步的生化分析。因此，目前尚需直接验证所观察到的上调现象对谷氨酸转运的功能影响。未来若能采用功能性摄取检测或膜定位技术，才能确定总EAAT1蛋白水平的上升是否真的意味着细胞表面转运蛋白活性的增强。在CUMS模型带来的病理状态下，星形胶质细胞中的EAAT1表达下降，GFAP表达也减少。EAAT1水平的下降会妨碍谷氨酸的清除，导致谷氨酸在突触间隙中积累。升高的细胞外谷氨酸会激活mGluR3，引发兴奋毒性级联反应；与此同时，过度的GIRK2激活会促使钾离子外流，进一步抑制神经元活动。过量的谷氨酸还可能通过谷氨酸脱羧酶（GAD65/67）被脱羧生成GABA，从而导致突触后GABA受体激活，打破兴奋性与抑制性之间的平衡。本研究中的所有分子检测都是在对整个额叶皮层组织进行的，无法区分神经元和胶质细胞的贡献。不过，所检测的几种蛋白都是成年中枢神经系统中已知的、具有细胞类型特异性的标志物。EAAT1（GLAST）主要在皮质星形胶质细胞中表达，在生理状态下神经元中的表达量极低[72]；因此，额叶皮层中总EAAT1蛋白水平的变化通常被认为反映了星形胶质细胞谷氨酸转运蛋白的功能变化[68]。GFAP作为成熟星形胶质细胞的典型中间丝蛋白，仍是批量组织研究中用于检测星形胶质细胞活化最常用的指标[66]。其他被检测的分子，如BDNF和GAD65/67，则主要来源于神经元。在本研究中，我们观察到GFAP和EAAT1同时出现上调，同时mGluR3和BDNF也发生了变化。这些星形胶质细胞和神经元标志物的协同变化表明，这是一种更广泛的星形胶质细胞与神经元之间的相互作用，而非单纯的星形胶质细胞激活。因此，我们的解释是基于多标志物网络，而非单一指标；总体而言，这些数据提示星形胶质细胞的支持功能，包括谷氨酸处理功能，可能有所改善。这一模式与先前的研究结果一致，那些研究显示抗抑郁干预能够同时恢复额叶皮层组织中的星形胶质细胞和神经元标志物[32]。不过需要强调的是，我们的数据虽然提供了反映星形胶质细胞参与的额叶皮层整体分子图谱，但并未直接证明细胞类型的特异性功能变化。最后，尽管GFAP可以指示星形胶质细胞的活化变化，但它并不能直接反映谷氨酸的摄取能力。GAD65/67蛋白水平升高的现象看似与抑郁症中GABA能功能减退的普遍观点相矛盾，但只要将GABA能功能减退理解为电路层面抑制作用减弱的机能性表现，而非合成酶蛋白的简单缺乏，这一矛盾就能得到解释[55]。与这一观点相符的是，慢性压力模型显示，即使GABA释放量下降，GAD65/67的水平却可能反常地上升——这一现象可被理解为机体试图恢复抑制功能的失败尝试[47]。因此，我们的研究结果与这种复杂的病理生理机制是一致的，而非相互矛盾的。在CUMS背景下，已有多种机制被提出，用以解释GAD蛋白含量与GABA组织浓度之间的分离现象[21]。首先，GAD蛋白水平升高并不一定意味着酶活性也随之上升；慢性压力可能会限制辅因子吡哆醛磷酸（PLP）的供应，还会引发使酶失活的翻译后修饰[24]。其次，由于GAT-1/GAT-3转运蛋白的活性上升或GABA转氨酶的作用加快，GABA的清除速度增加，可能导致新合成的GABA迅速被消耗，从而使组织中的GABA水平总体下降[23][8]。第三，星形胶质细胞功能异常可能会干扰谷氨酸-谷氨酰胺循环，进而限制GABA合成的前体物质供应。我们所观察到的EAAT1变化间接支持了这一可能性，因为谷氨酸转运功能受损会破坏神经元与星形胶质细胞之间的代谢协作[34][7]。在任何一种情况下，GAD蛋白水平的上升都只是一种无效的代偿反应，无法真正恢复GABA水平。结合Kir3.2以及其他谷氨酸/GABA系统组分的改变，现有数据表明的是兴奋性与抑制性平衡的广泛紊乱，而非单纯的酶学变化。由于我们仅采用了单一指标进行检测，因此这里报告的数据只能揭示相关性，而非Glu–mGluR3–BDNF信号通路的因果关系。本研究中所讨论的信号传导框架并非仅仅基于当前的研究结果，它还借鉴了先前的机制研究，这些研究表明mGluR3可以通过ERK/CREB以及PI3K/Akt/mTOR途径调控BDNF的表达[35]，而慢性压力会破坏这种调控关系，抗抑郁药物则可以恢复这种调控[18]。当前的研究结果表明，在CUMS状态下，针灸能够同时调节mGluR3和BDNF的表达。虽然这种时间上的同步变化并不能确立因果关系，但它与针灸可能作用于这一信号通路的假设相符，也为这一合理的机制框架提供了支持。考虑到这一局限性，我们在整篇论文中都用关联性和概率性表述替代了因果性表述（例如，“mGluR3的变化伴随着BDNF的平行变化，这表明两者可能存在共调控关系”）。因此，我们将Glu–mGluR3–BDNF之间的关系视为一种基于先前文献的假设；本研究提供的只是相关性证据，未来还需通过时间序列实验、mGluR3的藥理阻断或BDNF基因敲低等方法，来确定其时间顺序和因果关联。总之，本研究表明针灸能够缓解CUMS大鼠的抑郁样行为，这一效应伴随着兴奋性氨基酸转运蛋白EAAT1和神经营养因子BDNF表达的上调，以及额叶皮层中谷氨酸、mGluR3、GAD67、GAD65和GIRK2表达的下调。这些分子变化与星形胶质细胞功能增强以及谷氨酸稳态改善是一致的。相反，假针灸处理以及同时给予mGluR3激动剂都会显著削弱针灸的疗效，这表明完整的mGluR3信号传导途径对针灸的效果具有重要作用。值得注意的是，此处报告的分子数据是基于单一指标检测得出的，因此只能揭示相关性，而非线性的因果链。在这种关联性的框架下，额叶皮层中的mGluR3被视为与针灸产生的抗抑郁样反应相关的潜在分子靶标，而非已被确认的关键靶点。我们推测，针灸可能通过调节Glu–mGluR3–BDNF信号通路来发挥其作用，这一假说还需通过时间进程实验、特定通路阻断或细胞类型特异性操作来验证，以确定其时间顺序和因果关系。5. 局限性本研究存在一些局限性：首先，行为测试仅根据现有文献在预定时间点进行，缺乏动态监测数据，因此难以全面掌握大鼠抑郁样行为的时间变化以及针灸起效的时间窗口。其次，本研究属于探索性研究，所得结论应视为初步结果，需在更大规模的独立队列中进一步验证才能确认并扩展这些观察结果。此外，在研究设计阶段，我们的主要目标是确定针灸对神经传递关键指标（mGluR3、BDNF、EAAT1、GAD65/67）的影响，因此初始实验方案并未包含中间信号传导步骤，也未直接量化p-CREB和磷酸化TrkB等下游激活标志物，而这些标志物本可更直接地建立mGluR3活性与BDNF表达之间的关联。由于实验方案已确定且剩余样本不足，无法补充这些数据，因此mGluR3调控与BDNF上调之间的机制联系仍有待实验验证。未来需要纳入这些信号中间体的研究来确认所提出的级联反应。本研究旨在通过交互作用策略检测mGluR3信号传导对针灸效应的必要性，核心机制结论是通过对比针灸组与针灸加LY404039组得出的。然而，由于没有仅使用药物的对照组，无法确定LY404039在该CUMS模型中是否具有独立的生物学或分子效应，也无法完全分离药物与针灸之间的相互作用机制。建议未来采用完整的2×2因子设计，系统区分激动剂单独的作用及其与针灸的交互作用。6. 结论本研究提供了初步证据，表明针灸能够改善CUMS大鼠的核心抑郁样行为。这些行为改善伴随着前额叶皮层中一系列协调的分子变化，包括EAAT1和BDNF的上调，以及mGluR3、GIRK2和其他谷氨酸/GABA相关蛋白的下调。这些发现并未显示出明确的线性级联反应，而是表明针灸的作用可能与Glu–mGluR3–BDNF信号通路的调节有关（如图7所示）。因此我们推测，针灸可能有助于恢复星形胶质细胞功能、促进谷氨酸清除并增强神经营养支持，不过具体的分子事件顺序和因果关系仍有待确定。在这一关联框架下，前额叶皮层中的mGluR3被视为与治疗反应相关的潜在分子靶点，而非已被明确证实的关键靶点。这些发现可为未来研究提供实验基础，探讨诸如针灸结合mGluR3调节剂之类的联合策略是否能为抗抑郁治疗带来新方法，当然这还需要直接的因果关系验证。下载：下载高分辨率图像（388KB）下载：下载全尺寸图像图7. 针灸对CUMS模型中抑郁样行为改善作用的示意图。伦理审批所有动物实验及方案均符合国际动物实验伦理标准，并已获得厦门大学动物伦理委员会的批准（许可号XMULAC20210062）。作者贡献每位作者都积极参与了研究的设计、实施和数据收集工作，参与了实验操作和结果分析。李负责撰写手稿，曾静宇和游卓然负责数据分析，沈俊良协助开展实验，彭丽负责手稿修订，孟贤军和Muhammad Asram负责手稿编辑，最终由孟贤军决定手稿是否发表。数据共享声明本研究使用的原始数据和材料将毫无保留地提供给所有符合条件的研究人员。资金支持厦门市中医药基金会（编号XWZY-2025-0505）、深圳市科技计划项目（编号JCYJ20230807091359029）、厦门大学本科生创新创业培育计划（编号2025Y1003）、山西省中医药管理局中医药创新团队建设计划（编号zyytd2024012）、福建省科技计划项目（编号2023D032）、山西省针灸学会科研项目（编号2024KT004）、深圳市科技计划项目（编号JCYJ20250604122904006）。CRediT作者贡献说明彭丽：正式分析；Muhammad Shahzad Aslam：可视化处理；刘思宇：数据整理；沈俊良：正式分析；孟丽：初稿撰写、正式分析、数据整理；宁莲莲：正式分析；黄淑琼：方法学研究；游卓然：正式分析、数据整理；方辉：数据整理；郝崇耀：监督、项目管理；李景轩：数据整理；陈凯丽：正式分析；曾静宇：正式分析、数据整理；严思敏：数据整理；孟贤军：审稿与编辑、资源协调、资金申请；李建国：正式分析。