尼古丁联合雌激素激活蛋白激酶PKCι（atypical protein kinase C iota, PRKCI）与TAO（Thousand-and-One amino acid kinase），同时抑制培养人神经元中特定MAPK（mitogen-activated protein kinase）通路：尼古丁使用障碍的激酶活性图谱

《Frontiers in Cellular Neuroscience》：Nicotine combined with estrogen activates protein kinase PKCι and TAO, while inhibiting specific MAP kinase pathways in cultured human neurons: an atlas of kinase activities for nicotine use disorder

　　

摘要：引言：女性对尼古丁的反应存在性别特异性差异，雌激素（estrogen）和孕酮等性激素在女性尼古丁成瘾中发挥关键作用。尼古丁干扰脑奖赏系统的神经元放电，该效应受雌激素调节。本研究假设人雌性神经元同时暴露于尼古丁和雌激素会激活独特的信号通路。方法：研究人员用人雌性SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞分别给予尼古丁、17β-雌二醇（17β-estradiol, E2）、二者联合处理及vehicle对照，采用PamGene PamStation技术检测每样本超过500种激酶底物的磷酸化水平，构建激酶活性图谱。结果：尼古丁对MAPK通路呈双向调节；雌激素产生独特激酶效应；二者联用引发多样化通路响应——部分激酶（包括PKCι和TAO）仅在联用时活性升高，且与啮齿类动物行为相关；反之，胰岛素受体（insulin receptor, INSR）、HER2（ERBB2）、FAK1（focal adhesion kinase 1, PTK2）和ABL1（ABL proto-oncogene 1, non-receptor tyrosine kinase）等在联用下活性降低。讨论：上述发现揭示了尼古丁特异的激酶机制，并为高雌激素水平女性尼古丁使用障碍（nicotine use disorder, NUD）的药物治疗提供了潜在靶点。

本文原载于《Frontiers in Cellular Neuroscience》。

【研究背景】

流行病学证据表明女性比男性更易患尼古丁依赖，且雌激素（尤其是卵泡期高峰的17β-雌二醇，E2）可增强尼古丁奖赏效应与渴求，加速成瘾进程（telescoping effect）。然而雌激素与尼古丁协同调控人神经元胞内信号通路的分子机制尚不清楚。既往研究多关注单一物质作用，缺乏二者联用对人神经元全激酶组（kinome）的系统解析。为此，研究人员以人雌性SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞为模型，利用高通量激酶芯片技术探究E2与尼古丁单独及联合处理下的激酶信号谱变化，旨在揭示性别相关的尼古丁成瘾信号机制并寻找潜在治疗靶点。

【主要关键技术方法】

研究人员采用人雌性来源SH-SY55神经母细胞瘤细胞系，设vehicle对照、1 μM E2、100 μM尼古丁及二者联合（先尼古丁预孵育30 min再加重E2共孵6 h）四组处理。提取总蛋白后，使用PamGene PamStation12平台分别在蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase, PTK）PamChip和丝氨酸/苏氨酸激酶（serine–threonine kinase, STK）PamChip上实时检测底物磷酸化信号，以反映激酶活性。生物信息学分析采用BioNavigator软件计算中位激酶统计量（median kinase statistic, MdKS）及火山图筛选显著差异激酶，并应用Kinome Random Sampling Analyzer（KRSA）R包进行上游激酶反向分析（Reverse KRSA）、Z-score家族评分及MEOW图展示置信度加权底物磷酸化变化；同时结合KEA3数据库与Human Protein Atlas人脑组织表达数据，在Cytoscape中构建脑表达过滤的激酶-底物互作网络。部分差异激酶的mRNA表达水平通过实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）以36B4为内参验证。

【研究结果】

3.1 磷酸酪氨酸激酶（PTK）信号分析

对PTK PamChip数据的热图与瀑布图分析显示，E2或尼古丁单独处理均引起较多PTK活性显著改变（如E2上调FYN、SRC、INSR，尼古丁上调INSR、ROR1、SRC等，下调EPHB1、MAP2K2/MAP2K7等），而二者联用整体PTK响应较单独处理减弱。联用组中HER2（ERBB2）、FYN、ALK（anaplastic lymphoma kinase, ALK）、ABL1活性被抑制，尽管其mRNA表达升高提示负反馈调节；INSR（insulin receptor）、INSRR（insulin receptor-related receptor）、ROR1活性在联用下略有升高，EPHB1活性降低。KRSA反向分析及MEOW图确认HER2、FYN、ALK、ABL受联用抑制最显著。

3.2 丝氨酸–苏氨酸激酶（STK）分析

STK底物整体磷酸化在三种处理下均高于对照，且联用组多数STK活性高于任一单独处理（如DAPK3、AURKB、PAK1、STK38L等上调），但AKT3、CDK6联用活性低于单独处理。重点关注的非典型PKCι（PKC-iota, PRKCI）和TAO1（TAO kinase 1, MAP3K16/TAO1）仅在E2+尼古丁联用条件下呈现显著升高的激酶活性（MEOW图确认PKCι各处理间差异显著，TAO1联用特异高活性），而TAO1 mRNA在联用组被抑制。p38 MAPK家族中MAPK12（p38γ）在尼古丁单独处理时活性显著升高。PDK1（3-phosphoinositide dependent protein kinase 1）在E2或尼古丁单独时活性升高，联用时增幅减小。

3.3 基于进化树与网络的全局激酶组概览

将PTK与STK按激酶家族绘制系统发生树（phyla tree），节点颜色代表MdKS反映的活性变化，节点大小反映显著性。联用组使部分激酶（如NEK8）呈现高置信度超活化，多个MAPK家族成员（如MAP2K4、MAP2K7）活性受抑，整体呈现双向（dichotomous and divergent）信号模式。Cytoscape构建的人脑表达过滤KEA3底物网络及BioNavigator上游激酶分析网络中，联用组特异地富集PKCι和TAO所在上游节点，再次印证二者为E2与尼古丁协同作用的核心枢纽激酶。

【讨论与结论翻译】

本研究表明雌激素与尼古丁联用在人神经元中激活PKCι与TAO激酶并抑制特定MAPK通路，揭示了此前未被充分研究的雌激素–尼古丁相互作用的胞内信号机制。PKCι与TAO参与神经元可塑性、细胞骨架重组及应激反应（JNK/p38通路），可能与雌性高雌激素状态下尼古丁奖赏增强及依赖形成有关。多种PTK（HER2、INSR、FAK1、ABL1）在联用下活性受抑提示复杂的交叉对话。本研究建立的激酶活性图谱可为针对高雌激素水平女性尼古丁使用障碍的药物研发提供分子靶点。局限性包括所用尼古丁（100 μM）与E2（1 μM）浓度高于生理血浆水平、SH-SY5Y细胞系未完全模拟成熟神经元、缺乏体内功能验证及雄性对照比较，未来需在原代神经元或动物模型中进一步确认行为学相关性及性别差异。综上，尼古丁与雌激素联用触发可能关联行为结局的激酶信号级联，PKCι与TAO是其中关键介质，该激酶图谱为后续尼古丁成瘾性别差异化机制研究奠定基础。