新疆乌鲁木齐患呼吸道疾病犊牛中牛肠道病毒(Bovine enterovirus, BEV) E2亚型(EV-E2)的检测与分子特征分析

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Detection and molecular characterization of bovine enterovirus E2 from dairy calves with respiratory disease in Urumqi, Xinjiang, China

　　

摘要(Abstract)：牛肠道病毒(Bovine enterovirus, BEV)是一种传染性病毒病原，可引起犊牛呼吸道感染及疾病暴发。本研究报道了2024年11月新疆北部某奶牛场犊牛群中发生的一起BEV相关疫情。方法(Methods)：采集58份有临床症状犊牛的鼻拭子样本，采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)及病毒宏基因组测序(viral metagenomic sequencing)检测常见牛呼吸道病毒。结果(Results)：病毒宏基因组分析显示患病样本中仅注释到一种牛源病原即BEV；RT-PCR进一步证实所有有症状犊牛鼻拭子均为BEV阳性，而健康牛样本中未检出，提示BEV可能是该呼吸道疾病的病原。成功分离到一株命名为XJ-FHT的BEV毒株，可导致犊牛呼吸道疾患。全基因组、编码多聚蛋白、VP1及P1区核苷酸与氨基酸序列比对及VP1氨基酸序列系统进化分析均将该分离株归为E2亚型(EV-E2)。讨论(Discussion)：本研究首次于2024年在新疆地区鉴定出与犊牛呼吸道疾病相关的BEV，分子特征与系统进化分析确定分离株属EV-E2亚型。上述发现强调了BEV在牛呼吸道感染中的潜在作用，并指出需持续开展监测与采取防控措施。

论文解读：新疆乌鲁木齐患呼吸道疾病犊牛中牛肠道病毒(BEV) E2亚型(EV-E2)的检测与分子特征分析

本研究发表于《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》。

一、研究背景与目的

肠道病毒(Enterovirus, EV)属于小RNA病毒科(Picornaviridae)，其中肠道病毒E种(Enterovirus E, EV-E，旧称Bovine enterovirus, BEV)可感染牛、马、羊等多种动物，既往多从腹泻或健康动物中检出，其致病机制与毒力尚不清楚。尽管EV-E被认为可致肺炎、腹泻及流产，但其在牛呼吸道疾病中的确切病原学作用长期缺乏来自中国的直接证据。2024年11月，新疆乌鲁木齐某奶牛场6月龄以下犊牛（n=400）暴发急性呼吸道疾病，表现为发热（＞40 ℃）、咳嗽、脓性鼻分泌物、厌食及体重减轻，常规抗菌与解热治疗7 d后康复。为明确此次暴发的病毒病因并表征分离株，研究人员开展了病原筛查、病毒分离、全基因组测序及系统进化分析。

二、主要关键技术方法

研究人员采集疫情中58头有症状犊牛鼻拭子及相邻牛栏36头临床健康牛鼻拭子；将58份患病样本混合提取病毒核酸构建文库，进行病毒宏基因组测序(viral metagenomic sequencing, Illumina NovaSeq 6000平台)并组装注释；针对BEV 5′-UTR及VP1基因设计特异引物行RT-PCR检测各独立样本；选取阳性样本滤液接种MDBK细胞进行病毒分离与传代，经透射电镜观察病毒颗粒；设计重叠引物组通过RT-PCR扩增分离株全基因组并Sanger测序拼接；采用MegAlign进行序列相似性分析，基于VP1氨基酸序列以最大似然法(Tamura–Nei模型，1000次bootstrap)构建系统进化树。

三、研究结果

Overview of the virome（病毒组概览）

对58份患病犊牛鼻拭子混合样本进行病毒宏基因组测序，共获得1,701,636条 reads，其中56,154条（3.3%）注释为哺乳动物病毒序列，BEV相关reads为39,970条，与BEV-E2参考株BEV IS1/Bos taurus/JPN/1990（GenBank LC150009）各基因核苷酸一致性75.5%–78.9%，提示存在BEV-E2型病毒。

Viral detection（病毒检测）

以RT-PCR靶向BEV 5′-UTR和VP1基因检测，58份有症状犊牛鼻拭子均为BEV阳性；36份健康牛鼻拭子均为BEV阴性。同期未检出牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛冠状病毒(BCV)、牛疱疹病毒1型(BHV-1)，表明BEV可能是本次新疆犊牛呼吸道疾病的致病原。

BEV isolation（BEV分离）

将BEV阳性鼻拭子滤液接种MDBK细胞，第1代即出现细胞病变效应(CPE)，第7代经RT-PCR确认分离到BEV毒株，命名为XJ-FHT。感染细胞24 h内出现细胞变圆，透射电镜观察到直径约20–30 nm、具典型BEV形态的球形病毒颗粒。

Sequencing and analysis of the whole genome of the BEV XJ-FHT strain（BEV XJ-FHT株全基因组测序与分析）

XJ-FHT全基因组长7,391 nt（GenBank PQ469036），含800 nt 5′UTR、6,525 nt开放读码框(ORF, nt 801–7325)编码2,174个氨基酸残基的多聚蛋白，及66 nt 3′UTR。

The BEV XJ-FHT strain shared high sequence identity with EV-E2 reference strains（BEV XJ-FHT株与EV-E2参考株高度同源）

XJ-FHT全基因组核苷酸与已知BEV株一致性66.6%–81.3%，与BEV-E2参考株BEV IS1/Bos taurus/JPN/1990最高（81.3%）；VP1区核苷酸一致性73.2%–78.9%、氨基酸一致性90.7%–94.3%；P1区核苷酸一致性75.8%–79.9%、氨基酸一致性92.6%–95.7%；多聚蛋白氨基酸一致性94.3%–96.8%，证实XJ-FHT属BEV-E2基因型。

Phylogenetic analysis（系统进化分析）

基于VP1氨基酸序列构建的最大似然系统进化树显示，XJ-FHT与已确认的BEV-E2参考株（BEV IS1/Bos taurus/JPN/1990、K2577、PS/42、EV_NGR_2017、UFSM-SV89）聚于同一分支，位于EV-E2进化簇内，支持其分类为BEV-E2亚型。

四、讨论与结论总结

既往BVDV、BCV、BHV-1被视为牛呼吸道疾病主要病原，但本次疫情样本中均未检出，而BEV在有症状犊牛中100%阳性、健康对照全阴性，强烈提示BEV-E2为本次呼吸道暴发的主要病原。此前仅EV-E2亚型被证实可致牛呼吸道疾患，国内多省市曾从腹泻病例中分离到BEV-E2，但新疆地区尚未见引起呼吸道疾病的BEV报道。XJ-FHT与致呼吸道疾病的国内外BEV-E2株亲缘关系最近。目前国内无商品化BEV疫苗，本研究所获毒株可用于后续灭活疫苗研发以防控BEV相关呼吸道与腹泻感染。

结论(Conclusion)：BEV-E2仅在58头患呼吸道疾病犊牛鼻拭子中检出而健康对照未检出，提示其为2024年新疆北部该起犊牛呼吸道疾病的可能病原。结果凸显BEV-E2在中国牛呼吸道感染中的潜在作用，强调开发有效疫苗以阻断传播并降低疾病严重度的必要性。