《Frontiers in Molecular Neuroscience》：The contribution of endocytic mediators to itch transmission
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慢性瘙痒是一种重大的健康负担，影响约四分之一成年人群的生活质量，并与焦虑、抑郁及自杀倾向增加密切相关。尽管其影响广泛，但驱动和维持慢性瘙痒的确切机制尚不清楚。脊髓中的非组胺能痒觉传递依赖于突触囊泡（Synaptic Vesicle, SV）释放胃泌素释放肽（G
慢性瘙痒是一种重大的健康负担，影响约四分之一成年人群的生活质量，并与焦虑、抑郁及自杀倾向增加密切相关。尽管其影响广泛，但驱动和维持慢性瘙痒的确切机制尚不清楚。脊髓中的非组胺能痒觉传递依赖于突触囊泡（Synaptic Vesicle, SV）释放胃泌素释放肽（Gastrin-Releasing Peptide, GRP）及其后续与胃泌素释放肽受体（Gastrin-Releasing Peptide Receptor, GRPR）的结合。虽然SV外排促进神经递质（如GRP）的释放，但由网格蛋白（clathrin）、接头相关激酶1（Adaptor-Associated Kinase 1, AAK1）和发动蛋白（Dynamin, Dnm）等关键蛋白介导的SV内吞对于从突触前膜回收和循环利用SV以维持信号传导至关重要。基于AAK1和Dnm介导的内吞是可逆转疼痛的可行靶点的证据，研究人员表征了这些内吞介质在调控痒觉通路突触传递中的作用。研究人员通过原位杂交和免疫荧光技术定位了编码AAK1、Dnm1和Dnm3的mRNA在小鼠背根神经节（Dorsal Root Ganglia, DRG）中GRP阳性神经元内的分布。利用遗传学和药理学手段干扰AAK1、Dnm1和Dnm3，以评估抓挠行为、运动活性和焦虑样行为的变化。最后，研究人员评估了这些处理对GRP释放的影响。遗传学和药理学干扰AAK1显著降低了抓挠行为，这与DRG和脊髓中Aak1 mRNA敲低得到确认相关。同样，DRG中Dnm1和Dnm3的siRNA介导敲低也减少了抓挠行为。关键的是，这些处理在不影响运动活性或焦虑样行为的情况下降低了GRP释放。综上所述，这些发现表明SV循环的破坏可减少痒觉相关信号和行为而不影响正常运动功能，为慢性瘙痒的治疗提供了一种新途径。
这篇发表于《Frontiers in Molecular Neuroscience》的论文聚焦于内吞相关分子在痒觉传递中的关键作用，为慢性瘙痒治疗开辟了全新靶点。痒觉作为复杂的感官模态，其负担远超皮肤表面——它与焦虑、压力、抑郁及自杀意念密切相关，严重影响患者生活质量。当前，尽管组胺是最广泛研究的瘙痒介质，但大量慢性瘙痒病例属于抗组胺药治疗无效的"非组胺能瘙痒"，包括特应性皮炎、银屑病和结节性痒疹等严重、致残性慢性瘙痒性皮肤病。这类疾病呈现典型的"瘙痒-搔抓-瘙痒"恶性循环，临床迫切需要针对非组胺能通路的新型止痒策略。
在神经机制层面，非组胺能痒觉信号由初级感觉神经元外周的G蛋白偶联受体（G Protein-Coupled Receptors, GPCRs）检测致痒原后，经中枢传入脊髓背角。关键神经递质胃泌素释放肽（Gastrin-Releasing Peptide, GRP）在该通路中发挥核心作用：初级感觉神经元中枢末梢释放GRP，激活脊髓背角兴奋性中间神经元上的GRP受体（Gastrin-Releasing Peptide Receptor, GRPR），而持续的GRP释放对维持痒觉传递至关重要。突触囊泡（Synaptic Vesicle, SV）循环是这一过程的细胞基础——SV外排释放神经递质，而SV内吞则从突触前膜回收囊泡组分以维持功能性囊泡池和持续信号传递。网格蛋白介导的内吞是维持SV池的主要机制，其中接头相关激酶1（Adaptor-Associated Kinase 1, AAK1）负责招募网格蛋白和AP2复合物至质膜并磷酸化AP2的μ2亚基；发动蛋白（Dynamin, Dnm）作为GTP酶则形成螺旋 collar 促进SV分裂。虽已有研究证实AAK1和Dnm介导的内吞在疼痛传递中可成为治疗靶点，但它们在痒觉信号中的作用尚未被表征。基于此，研究人员开展了本项研究，旨在阐明内吞介质调控痒觉通路突触传递的机制，并验证干扰SV内吞能否有效减弱痒觉信号。
本研究采用的关键技术方法主要包括：利用C57BL/6小鼠（8-10周龄，雌雄各半，样本量n=8/组）建立氯喹诱导的非组胺能瘙痒模型；通过颈段鞘内（脊髓C4水平）注射siRNA（靶向AAK1、Dnm1、Dnm3或对照）实现基因敲低，或鞘内给予药理学抑制剂（AAK1抑制剂LP935509、Dnm抑制剂Dyngo4a、网格蛋白抑制剂PitStop2）；运用RNAScope原位杂交技术结合免疫荧光定位内吞介质mRNA在GRP阳性神经元中的表达；采用行为光谱仪系统记录并量化抓挠行为、运动活性、探索行为及焦虑样行为；通过高钾刺激下的离体脊髓外灌流实验，结合酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）检测GRP释放量；使用实时定量逆转录聚合酶链反应（Quantitative Real-Time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, qRT-PCR）验证靶基因表达变化。
研究结果部分按以下主题展开：
内吞介质在痒觉相关神经元中的表达定位。研究人员通过RNAScope原位杂交结合免疫荧光检测，发现Aak1、Dnm1和Dnm3的mRNA高度表达于小鼠DRG和脊髓背角的GRP阳性（GRP
+ve）神经元中。具体而言，Aak1 mRNA在90%的DRG GRP阳性神经元中检测到，Dnm1 mRNA占80%，Dnm3 mRNA占90%。在脊髓中，这三种mRNA主要表达于背角深层神经元，同时也在表浅层（Lamina I、II、III）的部分GRP阳性神经元中表达，证实这些内吞介质定位于痒觉传递相关神经元亚群。
AAK1基因敲低减轻抓挠行为。通过鞘内注射AAK1 siRNA，研究人员在DRG中实现Aak1 mRNA表达降低50%±2%，在脊髓中降低72%±9%。在氯喹诱导的瘙痒模型中，AAK1敲低使抓挠行为减少48%±6%，且雄性和雌性小鼠均表现出相似的抗瘙痒效应。重要的是，AAK1敲低未影响平均速度、轨迹长度、运动活性、移动百分比或中心区域访问次数等非诱发行为，表明该干预选择性作用于病理痒觉而不干扰正常神经功能。
AAK1药理学抑制 attenuates 抓挠行为。使用选择性AAK1抑制剂LP935509（10 μg/5 μL，鞘内注射1小时后给予氯喹），抓挠行为减少62%±4%，该效果在雌雄小鼠中一致。同样，LP935509未改变任何运动或焦虑样行为参数，与siRNA结果相互印证。
Dnm1和Dnm3基因敲低减轻抓挠行为。Dnm1 siRNA使DRG中Dnm1 mRNA降低57%±7%，使抓挠行为减少46%±11%（合并性别数据），但单独按性别分析时仅雄性组显著。Dnm3 siRNA使DRG中Dnm3 mRNA降低52%±6%，抓挠行为显著减少69%±4%，且该效果在单独分析雌雄数据时均显著。两种Dnm亚型敲低均未影响运动活性或焦虑样行为。
内吞介质敲低减少GRP释放。在离体脊髓高钾（90 mM KCl）去极化刺激实验中，AAK1敲低以及Dnm1+Dnm3联合敲低均显著降低了诱发性GRP释放（iGRP），基线释放也呈现下降趋势。该结果直接证明干扰SV内吞减少了痒觉关键神经递质的释放。
在讨论部分，研究人员系统总结了上述发现并深入阐释其意义。鉴于瘙痒与痛觉共享神经通路，而AAK1、Dnm1和Dnm3已被证实是伤害性通路中SV循环的介质，本研究首次将这些发现拓展至痒觉领域。GRP/GRPR信号作为非组胺能痒觉的最终共同通路，其持续激活依赖于高效的SV循环以维持神经递质释放。研究人员推测，AAK1通过磷酸化AP2的μ2亚基促进网格蛋白介导的SV内吞，而Dnm作为GTP酶催化SV分裂，二者共同维持SV池的稳态。只有在致痒原刺激导致神经元高度活跃、需要快速SV回收时，这些内吞介质的阻断才显现出显著效应，这解释了为何基础神经功能得以保留。
研究结论强调：SV内吞的破坏可减少痒觉相关信号和行为而不影响正常运动功能。AAK1和Dynamin亚型通过调控SV循环维持持续的GRP释放，从而成为管理慢性瘙痒的有前景的新型靶点。这种针对病理状态中高活性神经传递的选择性干预策略，有望避免全局性内吞抑制带来的严重副作用，为开发不损害正常运动功能的止痒药物提供了理论基础和实验依据。研究人员指出，AAK1拮抗剂LX9211已在一期临床试验中证明安全性和耐受性，而Dnm抑制剂如丙氯拉嗪等已有药物也显示了 repurposing 的潜力，进一步增强了该策略向临床转化的前景。
