补阳还五汤对低气压缺氧致小鼠脑损伤的保护作用及机制：涉及炎症反应与HIF-1/PI3K-Akt相关信号通路

《Frontiers in Immunology》：Protective effect and mechanisms of Buyang Huanwu decoction against hypobaric hypoxia-induced brain injury in mice: involvement of inflammatory responses and HIF-1/PI3K-Akt-related pathways

　　

摘要： 背景/目的：本研究旨在探讨补阳还五汤（Buyang Huanwu Decoction，BHD）对低气压缺氧（hypobaric hypoxia）致小鼠脑损伤的预防性保护作用，并阐明其潜在机制，重点评估BHD预处理能否预防或减轻低气压缺氧诱导的神经功能障碍与海马损伤，并从炎症反应、代谢调控及HIF-1/PI3K-Akt相关通路角度阐释其作用机制。 方法：通过建立模拟海拔6000 m低气压缺氧环境持续暴露72 h的小鼠模型，将小鼠分为正常对照组、模型组、BHD预处理组及乙酰唑胺（acetazolamide）阳性对照组。BHD及乙酰唑胺于低气压缺氧暴露前4天开始每日一次灌胃给药，并持续至暴露期间。采用旷场实验（open field test，OFT）评估自发活动与探索行为；苏木精-伊红（hematoxylin and eosin，HE）染色、尼氏（Nissl）染色及HIF-1α免疫荧光染色评价海马损伤；整合血清非靶向代谢组学、网络药理学、海马转录组学及RT-qPCR验证探究BHD预处理潜在机制。 结果：BHD预处理可改善低气压缺氧引起的行为异常，减轻海马病理损伤、神经元丢失及尼氏体减少，并降低海马区过度表达的HIF-1α。多组学分析提示BHD的保护作用与调控炎症反应、代谢紊乱及HIF-1/PI3K-Akt信号相关。RT-qPCR验证显示BHD调节海马组织中HIF-1α、IL-6、VEGFA、NF-κB1及STX1A的异常表达。 结论：BHD对低气压缺氧致小鼠脑损伤具有预防性神经保护作用，其效应可能涉及协同调控缺氧反应、炎症信号、代谢重塑及HIF-1/PI3K-Akt相关信号通路。

论文解读：补阳还五汤对低气压缺氧致小鼠脑损伤的保护作用及机制——涉及炎症反应与HIF-1/PI3K-Akt相关通路

该研究发表于《Frontiers in Immunology》。低气压缺氧性脑损伤是高海拔脑损伤（high-altitude cerebral injury，HACI）的重要实验病理基础，其核心病理过程包括供氧不足、氧化应激加剧、神经炎症放大、血脑屏障破坏及神经元与胶质细胞功能受损，最终导致脑组织结构与功能异常。海马作为学习记忆的关键脑区，因其高度依赖能量代谢和突触可塑性，对缺氧刺激尤为敏感。补阳还五汤（Buyang Huanwu Decoction，BHD）是经典中药复方，既往研究显示其在缺血性脑损伤中具有多成分、多靶点、多通路调节作用，可改善神经功能、抑制氧化应激与炎症、促进血管新生及突触可塑性，但其对低气压缺氧性脑损伤的保护作用及是否通过调控HIF-1（hypoxia-inducible factor-1）与PI3K-Akt（phosphoinositide 3-kinase-protein kinase B）通路发挥作用尚缺乏系统证据。因此研究人员建立低气压缺氧小鼠脑损伤模型，综合行为学、组织病理学、非靶向代谢组学、网络药理学、转录组学及分子生物学验证，探讨BHD的预防性神经保护作用及其通过HIF-1/PI3K-Akt相关通路调控炎症反应与代谢重塑的机制。

研究人员采用8周龄雄性SPF级C57BL/6J小鼠（n=8/组），随机分为正常对照组（CON）、低气压缺氧模型组（MOD）、乙酰唑胺阳性对照组（ACZ，100 mg/kg/d）及补阳还五汤高（BHD-H，7.82 g/kg/d）、中（BHD-M，3.91 g/kg/d）、低剂量组（BHD-L，1.955 g/kg/d）。BHD按经典临床剂量经体表面积换算并以冻干粉配制，ACZ为阳性对照。各干预组于低气压缺氧暴露（模拟海拔6000 m，72 h）前4天起每日灌胃给药，持续至暴露结束。建模后行旷场实验评估行为；取脑行HE染色、Nissl染色及HIF-1α免疫荧光；采集血清行非靶向代谢组学（LC-MS/MS）；利用TCMSP、BATMAN-TCM、GeneCards等数据库进行网络药理学分析获得共同靶点与KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集；取海马组织行RNA-seq转录组测序与差异表达及KEGG/GO（Gene Ontology）分析；采用RT-qPCR验证HIF-1α、IL-6、VEGFA、NF-κB1、STX1A的相对表达量。

3.1 Identification of the main chemical constituents of BHD（补阳还五汤主要化学成分鉴定）

研究人员通过UHPLC-Q Exactive LC-MS对BHD水提物进行质量控件分析，鉴定出毛蕊异黄酮葡萄糖苷（calycosin-7-O-β-D-glucoside）、阿魏酸（ferulic acid）、芍药苷（paeoniflorin）、藁本内酯（senkyunolide A）、羟基红花黄色素A（hydroxysafflor yellow A）、苦杏仁苷（amygdalin）、次黄嘌呤（hypoxanthine）及腺苷（adenosine）等代表性成分，证实制备的BHD含方中主要药材特征成分，符合后续药效与机制研究要求。

3.2 Effects of BHD on behavioral deficits and hippocampal HIF-1α expression in mice with hypobaric hypoxia-induced brain injury（BHD对低气压缺氧致脑损伤小鼠行为缺陷及海马HIF-1α表达的影响）

旷场实验显示模型组小鼠中心区移动距离、中心区距离占比及平均速度显著降低，进入中心区潜伏期显著延长，表明自发活动与探索行为受抑；BHD预处理各剂量组上述指标均显著改善。免疫荧光显示模型组海马CA1、CA2、CA3及齿状回（dentate gyrus，DG）区HIF-1α表达显著升高，BHD预处理显著降低CA1、CA3及DG区HIF-1α平均光密度值。提示BHD可逆转低气压缺氧所致行为异常并抑制海马HIF-1α过度激活。

3.3 Effects of BHD on hippocampal morphological changes induced by hypobaric hypoxia（BHD对低气压缺氧诱导海马形态学改变的影响）

HE染色显示模型组CA1、CA2、CA3及DG区神经元数量显著减少，伴胞质深染、排列紊乱；BHD-H组CA1区神经元数恢复至近正常水平，BHD-H显著抑制CA3区神经元丢失，各BHD剂量组均显著提升DG区神经元数（BHD-H最优），CA2区改善相对有限但呈恢复趋势。表明BHD尤其是高剂量可减轻低气压缺氧所致海马神经元结构性损伤。

3.4 Effects of BHD on Nissl bodies in the hippocampus of mice exposed to hypobaric hypoxia（BHD对低气压缺氧暴露小鼠海马尼氏体影响）

Nissl染色示模型组各海马分区尼氏体数量明显减少，BHD预处理各剂量组尼氏体数量均有不同程度回升，BHD-M在CA1、CA3及DG区改善较明显。提示BHD可部分阻止低气压缺氧引起的神经元合成功能受损。

3.5 Effects of BHD on serum metabolites in mice with hypobaric hypoxia-induced brain injury（BHD对低气压缺氧致脑损伤小鼠血清代谢物的影响）

非靶向代谢组学PLS-DA与OPLS-DA显示CON与MOD组、MOD与BHD-M组血清代谢谱明显分离，BHD-M组代谢谱趋近CON组。BHD显著回调L-组氨酸（L-histidine）、对甲酚硫酸盐（p-cresol sulfate）、猪胆酸（hyocholic acid）及甘氨胆酸（glycocholic acid）等差异代谢物。KEGG富集提示差异代谢物主要涉及中心碳代谢（central carbon metabolism in cancer）及氨基酸生物合成等通路，表明BHD可通过重塑代谢网络发挥保护作用。

3.6 Network pharmacology revealed the potential targets and pathways of BHD against hypobaric hypoxia-induced brain injury（网络药理学揭示BHD抗低气压缺氧脑损伤的潜在靶点与通路）

获得BHD与高海拔脑损伤共同靶点72个，PPI（protein-protein interaction）网络筛选核心靶点为TNF、EGFR、IL6、TP53及NF-κB1。GO富集显示BHD主要影响细胞外基质组织、质膜外侧及免疫反应；KEGG富集显示共同靶点显著富集于HIF-1信号通路、AGE-RAGE（advanced glycation end product-receptor for AGE）信号通路及PI3K-Akt信号通路等，提示BHD可能通过调控上述核心靶点与通路减轻低气压缺氧脑损伤。

3.7 Transcriptomic characteristics of hippocampal tissue after BHD intervention and RT-qPCR validation（BHD干预后海马组织转录组特征及RT-qPCR验证）

CON vs MOD差异基因2632个（上调1366/下调1276），MOD vs BHD-M差异基因1145个（上调616/下调529）。CON vs MOD差异基因KEGG富集于PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、黏着斑（focal adhesion）及ECM-受体相互作用等；PI3K-Akt信号通路在网络药理学与转录组中均被富集。RT-qPCR验证显示模型组海马HIF-1α、IL-6、VEGFA、NF-κB1及STX1A mRNA表达上调，BHD预处理各剂量组均不同程度下调上述基因，其中BHD-M对HIF-1α与NF-κB1下调作用较明显。结果支持BHD通过调控HIF-1/PI3K-Akt相关网络调节缺氧反应、炎症及突触功能相关基因表达。

讨论与结论总结

研究人员在讨论中指出，低气压缺氧可致小鼠行为抑制、海马神经元与尼氏体丢失及HIF-1α过度表达，BHD预处理能改善上述表型。网络药理学与转录组均提示PI3K-Akt信号通路为BHD作用的重要分子基础，并与HIF-1缺氧反应网络交互。代谢组学显示BHD回调氨基酸、胆汁酸及微生态相关代谢物，提示代谢重塑参与保护机制。研究局限性包括未行细胞分型双标免疫荧光、CA2区恢复较弱可能因区域特异性易感性、给药为预防性而非治疗性、行为学仅用旷场实验及部分检测样本量偏小，需后续研究补充。

结论（翻译）：本研究表明，BHD预处理可预防或减轻低气压缺氧致小鼠行为异常与海马损伤，表现为旷场表现改善、神经元及尼氏体丢失减少、海马HIF-1α表达下降。整合代谢组学、网络药理学、转录组学及RT-qPCR分析提示，BHD的保护作用可能与协同调控代谢重塑、炎症反应、突触功能障碍及HIF-1/PI3K-Akt相关信号有关。这些发现为BHD多成分、多靶点、多通路对抗低气压缺氧性脑损伤的保护潜力提供了实验依据，关键代谢物与信号靶点的因果作用尚需进一步验证。