使用RNA004化学方法评估Dorado v5.2.0从头碱基识别模型检测tRNA修饰的性能

《BMC Genomics》：Evaluation of Dorado v5.2.0 de novo basecalling models for the detection of tRNA modifications using RNA004 chemistry

　　

牛津纳米孔技术（ONT）的直接RNA测序能够捕获反映序列和化学修饰的核苷酸特异性电流信号，为直接从天然RNA分子中检测RNA修饰提供了潜力。为了解读此类信号，ONT提供了修饰感知的碱基识别模型，用于估计每个核苷酸处特定修饰的概率。2025年5月，ONT发布了针对假尿苷（Ψ）、肌苷、N⁶-甲基腺苷（m⁶A）和5-甲基胞苷（m⁵C）的更新修饰识别模型，并新增了针对2′-O-核糖甲基化的模型（Dorado v5.2.0），这需要独立验证。在此，研究人员利用裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）的细胞外tRNA（ex cellulo tRNAs）及其明确的修饰图谱，对Dorado v5.2.0与v5.1.0进行基准测试。研究人员生成了单核苷酸分辨率的修饰概率谱，并使用精心整理的已注释和已验证的修饰位点集来量化模型性能。研究结果表明，尽管在Ψ检测方面有显著改进，但大多数修饰识别器在处理tRNA密集且异质的修饰环境时仍然面临挑战。这项工作首次对Dorado v5.2.0在天然tRNA上的性能进行了全面评估，并为在复杂的RNA修饰背景下基准测试未来的ONT修饰模型建立了一个方法学框架。

**论文解读：基于纳米孔直接RNA测序的tRNA修饰检测模型评估**

**研究背景与意义**
RNA的化学修饰，统称为“表观转录组”，在确保各类RNA正常功能中发挥着至关重要的作用。其中，转运RNA（tRNA）的修饰与人类癌症、神经系统疾病等健康问题密切相关，凸显了该领域的研究价值。准确检测RNA修饰，尤其是在单碱基和单分子分辨率上，对于理解其生物学功能至关重要。牛津纳米孔技术（ONT）的直接RNA测序（dRNA-seq）提供了一种有前景的方法，它通过测量RNA分子穿过生物纳米孔时产生的特征性电流信号，不仅能够识别序列，理论上还能直接检测碱基修饰。

为了从电流信号中解读修饰信息，ONT开发了修饰感知的碱基识别模型，能够直接预测特定修饰存在的概率，即“从头”修饰识别。2025年5月，ONT发布了更新版的Dorado v5.2.0模型，涵盖了假尿苷（Ψ）、肌苷、m⁶A、m⁵C以及新增的四种核糖2′-O-甲基化（Nm）修饰识别器。然而，这些模型在复杂的生物样本，尤其是修饰位点密集且种类繁多的tRNA环境中的性能，尚未经过系统评估。发表在《BMC Genomics》上的这项研究，旨在填补这一空白，对Dorado v5.2.0模型进行首次全面评估，并建立一个可用于未来模型基准测试的方法学框架。

**关键技术方法概述**
本研究主要采用比较分析的方法，评估Dorado v5.2.0相较于v5.1.0在tRNA修饰检测上的性能。核心数据来源于裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）的细胞外tRNA样本以及体外转录（IVT）的未修饰tRNA对照样本，所有样本均使用ONT的SQK-RNA004试剂盒进行直接RNA测序。数据处理流程包括：使用Dorado v5.1.0和v5.2.0模型进行碱基识别和修饰概率评分；将测序读数与参考tRNA序列进行比对和严格过滤；为每个位点定义“修饰可能性”（modification likelihood, ml）分数，该分数基于高修饰概率（>80%）与低修饰概率（<20%）的读数比例计算，并排除了中间概率的读数以减少非特异性修饰信号的干扰。最后，利用IVT对照样本的背景分布设定分类阈值，以二进制方式（修饰/未修饰）评估各识别器的真阳性率和假阳性率。

**研究结果分析**

**1. Dorado v5.2.0 假尿苷（Ψ）识别器的性能提升与局限**
比较分析显示，v5.2.0的Ψ识别器在特异性方面有所改进。与v5.1.0相比，v5.2.0在多个已知Ψ位点（如Ψ13和Ψ55）显示出更高的修饰可能性分数，表明检测能力提升。更重要的是，v5.2.0模型显著降低了对多种非Ψ尿苷修饰的误报率，例如对ncm⁵U、mcm⁵U、mcm⁵s²U和Um修饰产生的脱靶信号减弱，表明其更好地区分了Ψ与其他尿苷修饰的特征信号模式。然而，该识别器仍存在局限性：首先，它对二氢尿苷（D）位点仍会产生较高的误报信号；其次，许多未注释修饰的尿苷位点也显示出升高的修饰可能性分数，这可能是邻近修饰干扰所致。应用分类阈值后，v5.2.0的Ψ识别器在128个已注释Ψ位点中正确检测出102个（真阳性率69.4%），但同时也在27个D位点、2个ncm⁵U位点、1个mcm⁵s²U位点以及33个未注释位点产生了假阳性信号。

**2. 其他修饰识别器在tRNA环境中的有限性能**
对于m⁵C识别器，v5.2.0版本在已知m⁵C位点的修饰可能性分数普遍低于v5.1.0，且与通过亚硫酸氢盐测序确定的实际修饰水平仅存在有限相关性。仅约一半的已知m⁵C位点能超过分类阈值，表明其假阴性率较高。同时，该识别器对3-甲基胞苷（m³C）的误报有所减少，但对N⁴-乙酰胞苷（ac⁴C）的误报增加。
对于肌苷识别器，在裂殖酵母tRNA的七个已知肌苷位点中，仅有一个位点（Ala-AGC I34）产生了高修饰可能性分数并通过了分类阈值，表明其在tRNA背景下的性能有限。
对于m⁶A识别器（tRNA中本不存在m⁶A），v5.2.0版本降低了对非靶标修饰如t⁶A和m¹A的误报概率，显示特异性有所改善。然而，该识别器在未修饰的IVT tRNA上仍产生较高的背景信号，表明其假阳性率依然较高。

**3. 新型2′-O-核糖甲基化（Nm）识别器的评估**
Dorado v5.2.0引入了Um、Cm、Am和Gm四种Nm修饰识别器。评估发现：
* **Um识别器**：对裂殖酵母tRNA中所有四个已注释的Um位点均表现出高灵敏度，但假阳性率很高，尤其对m⁵U位点产生强烈信号，因此该模型可能被用于间接推断m⁵U的存在。
* **Cm识别器**：对已注释的Cm位点灵敏度高，且假阳性率相对较低。
* **Am识别器**：背景假阳性率最低，但裂殖酵母tRNA中唯一推断的Am位点未能被检测到，由于位点稀缺，难以进行稳健评估。
* **Gm识别器**：对约65%的已注释Gm位点有中等灵敏度，但会错误地将m²₂G和m⁷G修饰分类为Gm。研究还发现，邻近m⁷G46的G45位点也出现高Gm分数，这种“邻位效应”在缺乏m⁷G的突变株中减弱，表明邻近修饰会干扰Gm的检测。

**4. 邻近修饰对Ψ识别的影响**
研究证实，Dorado v5.2.0的Ψ识别器仍然对邻近的修饰敏感。例如，Elongator复合物依赖的U34修饰（如ncm⁵U34）、queuosine（Q34）以及i⁶A37的存在，会干扰邻近Ψ位点（如Ψ32、Ψ35、Ψ39）的Ψ概率评分，导致其检测信号降低或无法检测。一个特别有趣的发现是，在部分tRNA中，位于m¹A58附近的Ψ55位点，其Ψ识别信号很低，同时却伴有较高的Um识别信号。在缺乏m¹A58的突变株中，Ψ55的Ψ识别信号恢复，Um误报信号降低。这表明m¹A58的存在可能导致Ψ识别器将Ψ55错误分类为Um55，或者抑制了Ψ55的实际形成。

**讨论与结论总结**
本研究系统评估了Dorado v5.2.0模型在复杂tRNA修饰背景下的性能。在v5.2.0模型中，Ψ识别器表现最为可靠，其对真正Ψ修饰的灵敏度高，且对许多其他尿苷修饰的误检减少，特别是与Um及Elongator依赖的U34修饰的区分能力得到提升。然而，该识别器仍对二氢尿苷敏感，并持续受到邻近修饰的干扰。其他识别器（如m⁵C、肌苷、m⁶A）在tRNA环境中的性能仍然有限，表现为高假阴性率或高假阳性率。新引入的Nm识别器性能各异，其中Um和Gm识别器受到脱靶修饰和邻位效应的显著影响。

这些发现强调了在解释纳米孔从头修饰预测结果时需要谨慎，并考虑修饰的序列上下文。在修饰密集的区域，准确检测特定修饰仍然是当前Dorado修饰识别器的一个显著限制。为了克服这些限制并验证修饰分配，结合正交验证方法（如LC-MS/MS、基于逆转录的错误谱分析、高通量测序技术等）至关重要。

**研究结论指出**：尽管某些识别器（特别是Ψ识别器）在从头识别修饰位点方面表现出良好性能，但对直接的修饰碱基识别结果应谨慎解读，理想情况下需要使用正交方法进行验证，以确保RNA修饰分配的可靠性。这项工作为在复杂的RNA修饰背景下基准测试未来的ONT修饰模型建立了一个方法学框架。