《Acta Neuropathologica》：Inhibition of tRNA fragments dysregulated in human mTLE exacerbates pathology and seizure activity
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摘要：内侧颞叶癫痫（mesial temporal lobe epilepsy, mTLE）是局灶性癫痫的一个亚型，约三分之一患者发展为药物抵抗性癫痫，可能由包括结构改变和非编码RNA（non-coding RNA, ncRNA）失调在内的多种机制驱动。然而，
摘要：内侧颞叶癫痫（mesial temporal lobe epilepsy, mTLE）是局灶性癫痫的一个亚型，约三分之一患者发展为药物抵抗性癫痫，可能由包括结构改变和非编码RNA（non-coding RNA, ncRNA）失调在内的多种机制驱动。然而，ncRNA在mTLE发病中的作用尚未完全阐明，许多ncRNA类别仍未被表征。值得注意的是，转运RNA（transfer RNA, tRNA）及其应激诱导的片段正成为基因表达的重要调节因子及潜在的体液生物标志物，但其在组织水平上的表达及在疾病发病中的作用仍不清楚。为此，研究人员通过对海马硬化型mTLE（mTLE-HS）与非海马硬化型mTLE（mTLE non-HS）患者及死后对照者的人海马和皮质样本进行总RNA测序（total RNA sequencing, RNA-seq）及小非编码RNA测序（small non-coding RNA sequencing, sncRNA-seq），对tRNA及tRNA衍生片段（tRNA-derived fragments, tRFs）进行了谱分析。数据显示人mTLE脑组织中pre-tRNA、成熟tRNA及tRF的神经表达发生广泛变化，其中最显著的变化是来源于tRNA-His-GTG的5'片段下调。通过在神经元细胞中敲低该tRNA及其5'片段并结合总RNA-seq，研究人员确定5'tRNA-His-GTG片段是基因表达的强效调节因子，可调控癫痫相关基因，例如大麻素受体1（Cannabinoid Receptor 1, CNR1）被鉴定为5'tRF-His-GTG的可能下游靶基因。为探究5'tRF-His-GTG对颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy, TLE）发病及癫痫发作活动的贡献，研究人员利用抑制剂靶向小鼠status epilepticus（SE，癫痫持续状态）后24 h观察到的该tRF表达升高，发现抑制其表达导致癫痫发作增加、网络活动改变（theta和alpha功率带降低）以及胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）表达增强。综上，本研究确认并拓展了先前发现，首次在人mTLE脑组织中鉴定到tRF表达的广泛改变，并首次证明tRF操作可影响癫痫发作活动及mTLE病理。
论文解读——Inhibition of tRNA fragments dysregulated in human mTLE exacerbates pathology and seizure activity
本研究发表于《Acta Neuropathologica》。内侧颞叶癫痫（mesial temporal lobe epilepsy, mTLE）中约三分之一患者对传统抗癫痫药物产生耐药，其发病机制涉及结构性改变及非编码RNA（non-coding RNA, ncRNA）失调，但tRNA衍生片段（tRNA-derived fragments, tRFs）在mTLE脑组织中的表达谱及功能作用此前未见系统报道。tRNA在应激下可被切割生成tRFs，具有类似microRNA的基因表达调控功能，但其在人类癫痫脑组织中的组织水平变化及是否参与癫痫发生或发作尚不清楚。本研究通过对人mTLE海马及皮质组织进行sncRNA-seq和总RNA-seq，结合体外细胞实验及小鼠癫痫模型体内干预，探讨tRF尤其是5'tRF-His-GTG在mTLE中的表达改变、调控机制及对癫痫病理和发作的影响。
主要技术方法
研究人员收集荷兰乌得勒支大学医学中心及荷兰脑库的mTLE患者（含mTLE non-HS及mTLE-HS/ILAE Type 1）和对照者死后海马（hippocampus, HC）与皮质（cortex, Cx）组织进行sncRNA-seq（检测tRF）和总RNA-seq（检测pre-tRNA及mRNA）；采用tDRmapper比对、DESeq2做差异表达分析。体外用LNA gapmeR敲低tRNA-His-GTG（含其5'片段）或用LNA inhibitor特异性抑制胞质5'tRF-His-GTG，进行RT-qPCR、Western blot、AGO2免疫沉淀（immunoprecipitation, IP）及RNA-seq。原代海马神经元（primary hippocampal neurons, PHN）行KCl去极化及低镁（Mg2+depletion）处理，分离星形胶质细胞和小胶质细胞行LPS处理。小鼠采用皮质内海人酸（intracortical kainic acid, ICK）模型诱导status epilepticus（SE），于SE后24 h海马内注射tRF inhibitor或阴性对照，植入遥测脑电图（electroencephalogram, EEG）记录自发性复发性癫痫发作（spontaneous recurrent seizures, SRS），并行免疫荧光染色（GFAP、Iba1）。
研究结果
Transfer RNA-derived fragments (tRFs) are dysregulated in mTLE
研究人员对人海马组织胞质sncRNA-seq发现mTLE non-HS与对照相比有120个差异表达（differentially expressed, DE）tRFs（FDR<0.05），核组分检出134个DE tRFs。最显著且持续下调的是源自tRNA-His-GTG的5'tRF-His-GTG和5'half-His-GTG，独立样本RT-qPCR验证其在mTLE non-HS海马中显著下调；mTLE-HS中下调更显著，可能与海马神经元丢失有关。结论：mTLE人脑组织中tRF表达广泛失调，5'tRF-His-GTG片段特异性下调。
Altered (pre)tRNA expression in the mTLE hippocampus
基于tRF读数汇总发现成熟tRNA-His-GTG在mTLE海马中也下调，而pre-tRNA-His-GTG（来自三个不同基因组位点）在mTLE non-HS胞质中上调，核/质比值分析提示pre-tRNA区室分布改变。tRNA生物合成关键酶（DROSHA、DICER、ANG、RNase Z、RNH1）在mRNA及蛋白水平均无显著变化。结论：mTLE海马中成熟tRNA-His-GTG下调伴pre-tRNA-His-GTG代偿性上调，非经典tRNA加工酶表达异常所致。
Activity-dependent and pro-inflammatory changes in 5'tRNA-His-GTG-derived fragments
小鼠海马发育及原代神经元培养过程中tRNA-His-GTG及5'tRF/5'half-His-GTG随成熟而上调，在星形胶质细胞和小胶质细胞中亦有表达。PHN经KCl去极化或Mg2+缺失诱导高活性后，5'tRF-His-GTG和5'half-His-GTG（非成熟tRNA）短暂上调；LPS处理微胶质可轻度下调5'half-His-GTG。结论：5'tRF-His-GTG片段受神经元活动正向调节、受炎症信号负向调节，具细胞类型特异性。
mTLE-associated changes in tRNA-His-GTG affect neuronal morphology and gene expression
用His-GTG gapmeR共敲低tRNA-His-GTG及其5'片段后，PHN出现胞体增大、突起缩短；Neuro-2a细胞RNA-seq显示441个差异表达转录本，富集于RNA加工、染色质、翻译等生物学过程，组氨酸重复蛋白编码基因倾向下调。结论：mTLE中观察到的tRNA-His-GTG轴改变可在体外引致神经元形态异常及广泛基因表达重编程。
5'tRNA-His-GTG fragments regulate gene expression
预测5'tRF-His-GTG的miRNA样靶基因，GSEA显示gapmeR敲低后这些靶基因显著上调（去抑制），提示5'tRF-His-GTG正常情况下抑制其表达。5'tRF-His-GTG和5'half-His-GTG可被AGO2免疫沉淀，在小鼠海马Ago2-IP smRNA-seq中也检出，证明其与RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex, RISC）结合。候选靶基因（Slc12a8、Stau2、Ankrd17、Ksr2及CNR1）在gapmeR处理后上调。结论：5'tRF-His-GTG以类miRNA方式结合AGO2并负调控癫痫相关基因表达，CNR1为其潜在靶标。
Targeting of 5'tRNA-His-GTG fragments in the cytoplasm using LNA inhibitors causes gene expression changes
胞质5'tRF-His-GTG特异性LNA inhibitor有效降低5'tRF-His-GTG和5'half-His-GTG水平但不影响成熟tRNA（或引起代偿性上调），pre-tRNA-His-GTG上调；抑制剂处理使预测的5'tRF-His-GTG靶基因（CNR1、SLC12A8、ANKRD17等）在Neuro-2a、SH-SY5Y及HEK293T细胞中上调。结论：特异性抑制胞质5'tRF-His-GTG足以解除其对靶mRNA的抑制，模拟mTLE中tRF缺失的基因表达效应。
Reciprocal regulation of 5'tRNA-His-GTG fragments and targets during experimental epileptogenesis
小鼠ICK模型SE后24 h海马5'tRF-His-GTG瞬时上调，同期Cnr1和Ksr2下调；人mTLE non-HS海马胞质RNA-seq显示CNR1上调，WB呈升高趋势。结论：实验性TLE急性期5'tRF-His-GTG与靶基因呈负相关（补偿性升高），慢性mTLE中tRF低表达则靶基因高表达，二者在人及小鼠中均呈相互拮抗表达模式，CNR1为关键下游效应分子之一。
Inhibition of 5'tRNA-His-GTG fragments causes aberrant brain activity and pathology
SE后24 h给予海马内tRF inhibitor敲低5'tRF-His-GTG，验证抑制剂有效性及Cnr1、Ankrd上调后，在ICK模型中发现：潜伏期无差异，急性期（前14天）SRS数无差异，但慢性期（D23–D29）抑制剂组SRS次数及总痫性活动时间显著增加；EEG功率谱分析显示theta（4–8 Hz）和alpha（8–12 Hz）频段功率降低；免疫荧光显示GFAP（星形胶质细胞活化标志）信号增强，Iba1（小胶质细胞标记）无变化。结论：抑制癫痫急性期生理性升高的5'tRF-His-GTG可加重慢性期自发性癫痫发作、诱发异常脑电活动（theta/alpha功率下降）并促进星形胶质胶质化，表明5'tRF-His-GTG具内源性抗癫痫及神经保护功能。
讨论与结论
研究人员讨论指出，人mTLE海马广泛存在tRF失调，5'tRF-His-GTG下调可能通过解除对CNR1等癫痫相关基因的抑制、引起神经元形态改变（胞体增大、突起缩短）及星形胶质活化参与癫痫发生发展。小鼠实验中急性期tRF一过性升高可能为代偿反应，慢性mTLE中其持续低表达则促进病理。tRF与AGO2结合并以miRNA样机制调控靶基因，pre-tRNA上调但tRNA加工酶未变提示可能存在tRNA核质转运或加工效率改变。本研究首次在人脑组织水平描绘mTLE的tRF表达谱，并首次通过体内功能获得/缺失实验证明tRF操控可影响癫痫发作及病理，为癫痫非编码RNA机制提供了新证据，tRFs有望成为颞叶癫痫新的治疗靶点或组织/体液生物标志物。
结论（翻译）
本研究确认并拓展了先前发现，在人内侧颞叶癫痫脑组织中鉴定到tRNA衍生片段（tRF）表达的广泛改变，并首次证明对tRF的操作可影响癫痫发作活动及mTLE病理改变。抑制在实验性TLE中上调的5'tRNA-His-GTG片段会加剧癫痫发作频率、脑电活动异常及胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达上调。这些发现表明tRF在mTLE中具有组织特异性失调及潜在致病/保护性作用，tRF可作为干预颞叶癫痫异常脑活动及其他病理性改变的潜在治疗靶点。
