《Basic Research in Cardiology》：Bicuspid aortic valve stenosis is characterized by increased angiogenesis, inflammation, and a higher valvular-to-systemic calcification ratio than tricuspid aortic valve stenosis
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钙化性主动脉瓣狭窄(Calcific aortic valve stenosis, AVS)是最需治疗的常见瓣膜性心脏病。尽管三叶式主动脉瓣狭窄(tricuspid aortic valve stenosis, AVS)与二叶式主动脉瓣狭窄(bicuspid
钙化性主动脉瓣狭窄(Calcific aortic valve stenosis, AVS)是最需治疗的常见瓣膜性心脏病。尽管三叶式主动脉瓣狭窄(tricuspid aortic valve stenosis, AVS)与二叶式主动脉瓣狭窄(bicuspid aortic valve stenosis, bAVS)在晚期均可发生钙化及功能受损，其病理生理机制尚不清楚。研究人员采用多种技术手段对术中取出的AVS、bAVS及主动脉瓣反流(aortic regurgitation, AR)对照瓣膜进行研究。鉴于重度钙化主动脉瓣组织常规处理的技术局限，研究人员建立了适用于人主动脉瓣组织的Kawamoto's film method，可获得保存良好的冰冻切片及高质量免疫组化染色。Bulk RNA测序(RNA-seq)分析及免疫组化染色显示，新生血管生成(angiogenesis)、炎症及钙化是区分bAVS与AVS的关键特征。研究发现bAVS中血管生成基因及CD31+细胞、炎症基因及CD45+细胞均显著升高。bAVS与AVS最显著的差异在于参与组织钙化的特异性基因——基质金属蛋白酶12(matrix metallopeptidase 12, MMP12)、牙本质基质酸性磷蛋白1(dentin matrix acidic phosphoprotein 1, DMP1)及蛋白聚糖4(proteoglycan 4, PRG4)的显著高表达，且micro-CT及von Kossa染色显示bAVS钙化程度约增高1.7倍。上述发现经1108例接受经导管主动脉瓣植入术(transcatheter aortic valve implantation, TAVI)的AVS与bAVS患者回顾性分析验证：bAVS患者主动脉瓣钙化更强(1.6倍)，但血管钙化负荷显著更低。这些数据提示AVS与bAVS为不同疾病实体，bAVS表现为局部炎症、新生血管生成及钙化增强，可为未来治疗策略提供指导。
论文解读：二叶式与三叶式钙化性主动脉瓣狭窄的病理差异及分子特征研究
本文发表于《Basic Research in Cardiology》。钙化性主动脉瓣膜狭窄是最常见的需治疗瓣膜性心脏病。三叶式主动脉瓣狭窄(tricuspid aortic valve stenosis, AVS)多见于老年，被认为与年龄相关的退变及动脉粥样硬化危险因素相关；二叶式主动脉瓣(bicuspid aortic valve, BAV)是最常见的先天性心脏畸形，其所致二叶式主动脉瓣狭窄(bicuspid aortic valve stenosis, bAVS)发病更早(40～60岁)，由先天性瓣叶融合致异常血流动力学加速退变。虽两者终末期均表现为瓣叶钙化及功能障碍，但其潜在分子病理生理是否存在本质差异长期不明。此外，传统钙化组织脱钙处理会破坏主动脉瓣组织结构及抗原性，严重限制组织形态学与分子分析。因此研究人员旨在采用不脱钙切片技术结合多组学方法，系统比较bAVS与AVS在分子表达、组织形态及临床影像上的差异，明确二者是否为独立疾病实体。
主要关键技术方法
研究人员收集德国波恩大学医院外科主动脉瓣置换术(surgical aortic valve replacement, SAVR)患者的离体瓣膜标本，分为bAVS组(n=32)、AVS组(n=26)及非钙化主动脉瓣反流(aortic regurgitation, AR)对照组(n=17)；另回顾性纳入行经导管主动脉瓣植入术(transcatheter aortic valve implantation, TAVI)的严重AVS与bAVS患者共1108例(三叶式1083例，二叶式25例)。为避免酸/EDTA脱钙破坏组织，建立并应用Kawamoto's film method对未脱钙钙化瓣膜进行低温冰冻切片。对部分瓣膜组织行bulk RNA-seq(RNA测序，n=34例：bAVS 13, AVS 14, AR 7)，其余行免疫荧光染色(CD31、CD45、α-SMA、Vimentin、Osteopontin等)、von Kossa及Movat五色染色；另取部分行micro-CT(micro-computed tomography，显微计算机断层扫描)钙化定量。TAVI队列于术前以CT评估瓣膜及髂股动脉钙化负荷。统计分析采用ANOVA或t检验等。
研究结果
Gene expression analysis in AVS and bAVS
研究人员对bAVS、AVS分别与AR对照行bulk RNA-seq。bAVS vs AR鉴定到447个差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)，远多于AVS vs AR的58个。GO(Gene Ontology，基因本体)富集显示bAVS上调基因富集于血管发育(angiogenesis)、细胞外基质(extracellular matrix, ECM)组织、TNF超家族细胞因子产生调控。bAVS vs AVS直接比较发现21个DEGs，其中钙化相关基因DMP1、PRG4、MMP12在bAVS中显著高表达，提示bAVS具有独特的促钙化转录谱。
Processing of strongly calcified human aortic valves with Kawamoto's film method
研究人员对比常规冰冻切片(含EDTA脱钙与未脱钙)与Kawamoto's film method处理同一钙化瓣膜。常规法致切片折叠、钙化灶崩落及结构丢失；Kawamoto法配合碳化钨刀片可完整切取含重度钙化区的瓣叶，保留CD31+内皮细胞层完整性，满足后续高质量免疫荧光分析。
Angiogenesis, inflammation, and endothelial barrier function in AVS and bAVS
CD31免疫荧光显示bAVS瓣叶内CD31+微血管密度显著高于AR对照(p<0.05)，高于AVS但未达显著性(p=0.0621)。RNA-seq热图证实bAVS中血管生成基因(ANGPT2、EMILIN2、FN1等)一致性上调，AVS中无此规律。CD45(泛造血细胞标记)染色示AVS与bAVS瓣叶近钙化区CD45+免疫细胞浸润均较AR显著增多；RNA-seq显示bAVS中炎症基因(IL1RN、IL6、IL11、CCL8、CXCL5、CXCL8、CCR1、CCR7及整合素ITGA4/ITGB2等)较AR明显上调，幅度大于AVS。白蛋白与CD31共染显示AVS与bAVS中内皮屏障破坏(白蛋白渗入瓣叶间质)，AR中则限位于内皮侧。
Extracellular matrix and calcifications in AVS and bAVS
bAVS vs AR中ECM及矿化相关基因(ACAN、STC1、DMP1、HIF1A、SPP1编码骨桥蛋白Osteopontin/OPN、IBSP、COL1A1等)显著上调；bAVS vs AVS中DMP1、MMP12、PRG4尤为突出。OPN免疫荧光定位于钙化结节外周细胞层。VIC(valve interstitial cell，瓣膜间质细胞)标志物α-SMA在AR仅分布于心室侧，AVS与bAVS中α-SMA异常表达于主动脉侧及钙化旁区域；Vimentin+VICs见于早期及致密钙化间软组织，不进入钙化核心。未观察到CD31与α-SMA/Vimentin共染提示无EndoMT(endothelial-to-mesenchymal transition，内皮-间质转化)证据。
Correlating CT scan, histomorphological, and clinical data in AVS and bAVS patients
micro-CT与术前临床CT吻合良好。von Kossa染色定量示bAVS瓣叶钙化面积占比(46.6±15%, n=13)较AVS(27.9±11.6%, n=12)高约1.7倍(p=0.0025)。Movat五色染色提示bAVS可呈多阶段钙化(心室侧矿化软骨样深蓝＋主动脉侧新生骨样红)，AVS多为单一阶段。TAVI队列CT分析确认bAVS相对瓣膜钙化(瓣环标准化钙体积)为AVS的1.6倍，而bAVS髂动脉(体循环血管)钙化负荷显著低于AVS。
讨论与结论翻译
本研究表明，尽管临床终末表现相似，bAVS与AVS是不同疾病实体。bAVS特征为局部新生血管生成、炎症及瓣膜钙化显著增强，伴MMP12、DMP1、PRG4等特异基因高表达，且患者体循环血管钙化较轻；AVS则与系统性血管/动脉粥样硬化性疾病关联更密切。Kawamoto's film method可有效保存未脱钙重度钙化瓣膜用于多模态分析。结论：二叶式主动脉瓣狭窄(bAVS)以局部炎症、新生血管生成及瓣膜钙化增强为特征，与三叶式主动脉瓣狭窄(AVS)的系统性血管病变模式不同，二者应视为独立疾病实体，上述发现可指导未来的靶向治疗策略。
