靶向人铜转运蛋白的64Cu缺氧成像放射性示踪剂

《NeuroMolecular Medicine》：64Cu Hypoxia Imaging Radiotracer Targeting the Human Copper Transporter

　　

通过功能成像对缺氧进行检测和表征，是肿瘤学、心脏病学和神经病学领域的一个关键前沿。尽管进行了大量努力，但稳健的缺氧成像生物标志物的临床转化仍因信号不理想而受限，从而影响了诊断准确性。本文报道了一种基于⁶⁴Cu的放射性示踪剂（⁶⁴Cu-CysPhe）的开发，该示踪剂利用了涉及人铜转运蛋白1（human copper transporter 1， hCtr1）的细胞铜摄取途径。这种靶向机制促进了示踪剂在缺氧组织中的选择性积聚。在小鼠乳腺癌模型中的体内正电子发射断层扫描-磁共振成像（PET-MRI）显示，注射后24小时内，肿瘤与肌肉的放射性摄取比值超过3.0。值得注意的是，免疫组织化学分析表明，⁶⁴Cu-CysPhe优先定位于缺氧肿瘤区域，同时排除了坏死核心，从而提供了关于肿瘤即时微环境的信息。与已建立的放射性示踪剂（包括⁶⁴Cu-ATSM和¹⁸F-FDG）的比较分析，证实了⁶⁴Cu-CysPhe在检测缺氧肿瘤区域方面的敏感性。这些发现确立了⁶⁴Cu-CysPhe作为一种非侵入性肿瘤成像的有前景候选物。

**基于人铜转运蛋白靶向的⁶⁴Cu-CysPhe：一种新型缺氧成像放射性示踪剂的开发与评估（论文解读）**

**研究背景与意义**
缺氧是一种生理状态，其特征是维持组织稳态所需的氧气供应不足。在肿瘤微环境中，缺氧在促进细胞增殖、血管生成和治疗抵抗方面起着关键作用。尽管功能成像（如正电子发射断层扫描，PET）为检测缺氧提供了可能，但临床上仍缺乏常规应用的、特异性的缺氧成像生物标志物。现有方法，如基于硝基咪唑衍生物（如¹⁸F-FMISO）或铜基示踪剂（如⁶⁴Cu-ATSM）的PET成像，存在局限性。硝基咪唑类示踪剂细胞摄取缓慢且被动，需要较长的注射后等待时间，而⁶⁴Cu-ATSM的作用机制（涉及被动扩散和通过人铜转运蛋白1（hCtr1）的主动转运）尚未完全阐明，导致结果可重复性不佳。同时，临床上广泛使用的¹⁸F-FDG（氟代脱氧葡萄糖）反映的是葡萄糖代谢，并非缺氧特异，且并非所有肿瘤都高摄取葡萄糖。因此，开发一种机制明确、能特异性靶向缺氧区域的新型放射性示踪剂，对于提高肿瘤诊断准确性、指导个性化治疗以及潜在应用于其他缺氧相关疾病（如缺血和神经退行性疾病）具有重要临床意义。本研究发表在《NeuroMolecular Medicine》上，旨在克服现有局限，报告一种新型⁶⁴Cu基放射性示踪剂⁶⁴Cu-CysPhe的开发与初步评估。

**关键技术方法概述**
研究人员设计并合成了由肽段（KSMAACAM，简称Cys）、有机配体（1,10-菲啰啉，Phe）和放射性核素⁶⁴Cu离子组成的复合物⁶⁴Cu-CysPhe。其设计灵感源于模拟铜离子在hCtr1蛋氨酸（Met）基序间传递的“齿轮”机制。研究采用了多种体外和体内技术进行验证与评估。体外表征技术包括拉曼光谱和电喷雾电离质谱验证复合物形成；电子顺磁共振波谱和等温滴定量热法分析复合物与hCtr1蛋白的相互作用及亲和力；全原子元动力学模拟评估复合物的细胞膜通透性。细胞实验使用人乳腺癌细胞（MCF-7）、小鼠淋巴瘤细胞（DA-3）、人宫颈癌细胞（HeLa）和小鼠乳腺癌细胞（4T1），在常氧和缺氧条件下，通过生物化学分析（如BCA法检测Cu(I)）和放射性摄取实验评估⁶⁴Cu-CysPhe的摄取、特异性及与hCtr1表达的相关性，并使用银离子（Ag(I)）竞争抑制实验验证hCtr1介导的摄取途径。体内研究在携带4T1小鼠乳腺癌细胞的BALB/c OlaHsd雌性小鼠模型中进行，通过显微PET-MRI成像评估⁶⁴Cu-CysPhe的生物分布、肿瘤摄取及肿瘤-肌肉比值，并辅以免疫组织化学染色（检测HIF-1α和caspase-3）分析肿瘤缺氧和凋亡状态，以及光声和多普勒超声成像评估肿瘤血管分布。此外，研究还进行了与⁶⁴Cu-ATSM和¹⁸F-FDG的对比成像实验。

**研究结果**
**1. ⁶⁴Cu-CysPhe的设计与表征**
研究人员设计了一种由肽段（Cys）、配体（Phe）和Cu(II)离子组成的三组分复合物。拉曼光谱和质谱分析证实了Cu-CysPhe复合物的形成，并显示了Cu-S配位。电子顺磁共振数据表明，复合物中的Cu(II)由配体的两个氮原子和肽段的两个硫原子（2N2S）配位，而在与hCtr1蛋白共存时，谱图变化提示复合物与hCtr1细胞外结构域发生了相互作用。等温滴定量热法测得复合物与hCtr1细胞外结构域片段的结合亲和力为2.2 ± 0.4 nM，略低于游离Cu(II)离子与hCtr1的亲和力（0.5 ± 0.2 nM）。全原子元动力学模拟表明，Cu-CysPhe复合物无法被动穿过脂质双分子层，这与已知具有高膜通透性的Cu-ATSM形成对比。

**2. 放射性⁶⁴Cu-CysPhe的细胞实验**
高效液相色谱分析显示，⁶⁴Cu与肽段和配体的结合效率超过95%，且在胎牛血清中至少稳定48小时。细胞摄取实验表明，在hCtr1高表达的MCF-7细胞中，⁶⁴Cu-CysPhe在缺氧条件下的摄取在注射后24小时显著高于常氧条件，且其摄取高于⁶⁴CuCl₂。在hCtr1表达很低的HeLa细胞中，⁶⁴Cu的积累也相应减少。使用Ag(I)离子竞争性阻断hCtr1的Met基序后，⁶⁴Cu-CysPhe的摄取被显著抑制，这支持了其摄取依赖于hCtr1的结论。在人源与鼠源乳腺癌细胞（MCF-7与4T1）中，⁶⁴Cu-CysPhe的摄取无显著差异。

**3. 体内PET-MRI成像**
在4T1荷瘤小鼠模型中，静脉注射⁶⁴Cu-CysPhe后，PET-MRI成像在注射后5小时和24小时均能清晰显示肿瘤轮廓，并成功区分了肿瘤边缘与坏死核心。示踪剂主要积聚在肝脏、肠道和肾脏，而在肺部和大脑中的积累较低。肿瘤与肌肉的放射性摄取比值在5小时为3.1 ± 0.5，在24小时为3.25 ± 1.4。免疫组化分析证实，PET-MRI信号富集的肿瘤外围区域呈现缺氧状态（HIF-1α阳性），而信号缺失的肿瘤中心区域则呈现广泛凋亡（caspase-3阳性）。光声和多普勒超声成像进一步显示，肿瘤血管主要分布在肿瘤边缘，中心区域缺氧。

**4. 与其他示踪剂的比较**
与⁶⁴Cu-ATSM的比较显示，在注射后5小时，两者的肿瘤-肌肉比值无统计学显著差异；但在24小时，⁶⁴Cu-CysPhe的比值（3.25 ± 1.4）略高于⁶⁴Cu-ATSM（2.47 ± 0.3），且⁶⁴Cu-CysPhe在大脑中的积累约为⁶⁴Cu-ATSM的一半。与¹⁸F-FDG的比较（不同时间点）显示，¹⁸F-FDG的肿瘤-肌肉比值更高，但¹⁸F-FDG在脑部有较高摄取，且其反映的是葡萄糖代谢而非特异性缺氧。

**讨论与结论**
鉴于识别和表征缺氧肿瘤的临床重要性，开发新型诊断性放射性示踪剂意义重大。本研究开发了一种基于细胞铜转运生物学机制、靶向hCtr1的⁶⁴Cu基放射性示踪剂⁶⁴Cu-CysPhe。多项体外实验和计算分析支持其摄取依赖于hCtr1相关过程，而非被动扩散。在乳腺癌小鼠模型中的初步体内研究表明，⁶⁴Cu-CysPhe能有效描绘肿瘤边界，特异性地在缺氧区域积累，肿瘤-肌肉比值高，且能从常氧组织中快速清除。与⁶⁴Cu-ATSM和¹⁸F-FDG的对比显示了其各自的特点和潜在互补价值。⁶⁴Cu-CysPhe利用了⁶⁴Cu合适的半衰期（12.7小时），合成简便，结合效率高，在缺氧肿瘤中摄取良好。因此，它代表了一种用于肿瘤缺氧诊断的新型放射性示踪剂。此外，由于缺氧也存在于缺血和神经退行性疾病中，该示踪剂未来可能应用于中风、阿尔茨海默病和帕金森病等疾病的诊断。

**研究结论（Conclusion）翻译：**
总之，研究人员基于细胞铜循环开发了⁶⁴Cu-CysPhe复合物。该复合物具有若干优势，包括⁶⁴Cu的12.7小时半衰期为缺氧环境中⁶⁴Cu(II)还原为⁶⁴Cu(I)后的成像提供了合适的时间窗口。该化合物的合成直接，结合效率超过95%（经HPLC UV/伽马检测验证）。此外，⁶⁴Cu-CysPhe在缺氧肿瘤中表现出良好的摄取，并能从常氧组织中快速清除。因此，它代表了一种用于诊断肿瘤缺氧状况的新型放射性示踪剂。最后，由于缺氧并非实体瘤所独有，也与缺血以及诸如α-突触核蛋白斑块和Aβ淀粉样蛋白等神经退行性病理相关，这种新开发的放射性示踪剂有潜力用于中风、阿尔茨海默病和帕金森病的诊断。