异时性骨髓移植改变中年小鼠的行为学指标

《Discover Neuroscience》：Heterochronic bone marrow transplantation alters behavioral measures in middle-aged mice

　　

认知和运动功能的年龄相关性衰退不仅受大脑内在变化影响，也受系统性因素（包括循环血液成分）调控。近期研究表明造血系统的"年轻化"可能影响大脑衰老，但中年时期进行骨髓移植（bone marrow transplantation, BMT）的效果尚不清楚。本研究以白消安（busulfan）预处理的中年（8月龄）C57BL/6小鼠为受体，分别移植年轻供体（2月龄）或同龄供体（8月龄）的骨髓细胞，进行异时性BMT（heterochronic BMT）。移植后3个月，接受年轻骨髓的BMT小鼠悬绳悬挂（wire-hang）潜伏期延长，开场实验（open field test）中心区停留时间存在差异，而新物体识别（novel object recognition, NOR）检测的物体识别记忆无变化。免疫组织化学分析显示年轻供体BMT小鼠齿状回（dentate gyrus, DG）双皮质素（doublecortin, DCX）及EdU阳性细胞有增加趋势但未达统计学显著性。综上，异时性BMT可能与中年小鼠部分选择性行为学指标的改变相关，需进一步研究以阐明系统性因素与年龄相关性脑改变的关系。

《异时性骨髓移植改变中年小鼠的行为学指标》——论文解读

本文发表于Discover Neuroscience。随着年龄增长，人和动物均出现运动及认知功能衰退，其机制除中枢神经系统的表观遗传改变、氧化应激和免疫失调外，近年研究发现循环血液成分等系统性因子（systemic factors）亦参与调控脑老化进程。异时性并联（heterochronic parabiosis）实验表明年轻血液循环可逆转老年小鼠部分神经发生减退及认知障碍，提示血液源性因子可调节脑衰老。作为更具转化潜力的手段，异时性骨髓移植（heterochronic bone marrow transplantation, BMT）——将年轻供体骨髓造血干细胞（hematopoietic stem cells, HSCs）移植入老年受体——已被报道可在经全身照射（total body irradiation, TBI）预处理的老年小鼠中保留认知功能。然而既往研究多聚焦老年晚期阶段，中年（认知衰退起始但尚未严重）时期BMT的影响鲜有报道；且传统TBI预处理可能损伤脑组织，因此本研究采用低神经毒性的白消安（busulfan）化疗预处理建立BMT模型，探讨异时性BMT与中年小鼠脑功能及行为的关系。

主要关键技术方法：

研究人员选用雄性C57BL/6小鼠，供体为2月龄（年轻）和8月龄（同龄），受体为8月龄。受体于移植前第?2、?1天腹腔注射白消安（20 mg/kg/天）进行清髓预处理，随后经尾静脉注入供体骨髓单细胞悬液（3×10?细胞/20 g体重）。移植后饲养3个月待供体造血重建后依次进行行为学测试：悬绳悬挂（wire hanging test）测神经肌肉性能、开场实验（open field test, OFT）测自发活动与焦虑样行为、新物体识别（novel object recognition, NOR）测识别记忆、自愿转轮跑（voluntary wheel running）测体力与动机、悬尾实验（tail suspension test, TST）测绝望样行为。组织学分析方面，处死前10天连续腹腔注射EdU标记增殖细胞，灌注固定后取脑制作冰冻切片，行双皮质素（doublecortin, DCX）及EdU免疫荧光染色，Click-iT法显色EdU，计数DG区EdU?/DCX?双阳性细胞并以切片抽样分数校正估算总数；同时检测海马CA1区vGluT1?/PSD95?突触斑点。统计学采用Student's t检验或Welch's t检验（方差不齐时），p＜0.05为差异显著。未直接检测供体造血嵌合比（donor chimerism）。

3.1 Behavioral analyses following heterochronic bone marrow transplantation（异时性骨髓移植后行为学分析）：

移植后3个月行为学检测显示，接受年轻骨髓细胞（young-donor BMT）的小鼠悬绳悬挂坠落潜伏期显著长于接受同龄骨髓（age-matched donor BMT）的小鼠，提示年轻供体造血系统可能改善中年小鼠神经肌肉/运动协调性表现。开场实验中，young-donor BMT组中央区停留时间显著少于age-matched donor BMT组，但总运动距离无组间差异，提示两组在探索性行为或对新环境的应激反应上存在差异。新物体识别测试中两组辨别指数（discrimination index）及总探索时间均无显著差异，表明在本实验条件下识别记忆未受异时性BMT明显影响。自愿转轮跑的总跑步时长与累计距离age-matched组高于young-donor组但无统计学意义；悬尾实验的不动时间亦无组间差异。综上，异时性BMT在中年小鼠中引起部分选择性行为学指标（悬绳悬挂、开场中心区时间）的改变。

3.2 Analysis of neurogenesis-related measures following heterochronic bone marrow transplantation（异时性骨髓移植后神经发生相关指标分析）：

为评估海马成年神经发生（adult neurogenesis），EdU标记增殖细胞并DCX标记未成熟神经元。估算每侧DG区EdU?/DCX?双阳性细胞数：age-matched donor BMT组为328±64.4，young-donor BMT组为588±116.5，后者呈升高趋势但差异未达显著性（p=0.1226，n=3/组）。海马CA1区vGluT1?/PSD95?共定位突触斑点数量两组间无显著差异。结果表明在白消安预处理下young-donor BMT有促进DG区新生神经元标记物增加的趋势，但未产生统计学显著的神经发生增强或CA1突触密度改变。

讨论与结论总结：

研究人员指出，此前辐照预处理下的异时性BMT可见年轻骨髓保留老年小鼠记忆功能，但本研究中8月龄（中年）受体未出现新物体识别记忆差异，可能由于小鼠造血系统老化约始于9–12月龄且血脑屏障尚较完整，循环造血源性因子对脑影响有限，或3个月观察窗不足。DG区EdU/DCX双阳性细胞数增加趋势与异时性并联研究报道方向一致，但样本量小未达显著，需更大样本验证。悬绳悬挂改善反映年轻供体造血系统可能对运动/神经肌肉功能具潜在益处；开场中心区时间减少可能为探索行为差异而非单纯焦虑改变。研究局限性包括未直接检测供体造血嵌合比、无移植前基线行为测定及未设未移植野生型对照组。最终结论为：异时性BMT与中年小鼠部分选择性行为学指标（悬绳悬挂潜伏期延长、开场实验中心区停留时间改变）相关联，DG区新生神经元标记有升高趋势但未达统计学显著，识别记忆无明显变化；提示异时性BMT可能通过系统性造血因子影响中年小鼠特定行为维度，具体机制及因果关系尚需结合嵌合比检测、扩大样本及更长随访进一步阐明。