利用光学窗口植入体对小鼠周围神经损伤反应进行纵向单轴突分辨率活体成像(Longitudinal Single-Axon-Resolution Imaging of Peripheral Nerve Injury Response in Mice Using an Optical Window Implant)

《Advanced Science》：Longitudinal Single-Axon-Resolution Imaging of Peripheral Nerve Injury Response in Mice Using an Optical Window Implant

　　

摘要：周围神经损伤(Peripheral Nerve Injury, PNI)与再生过程的慢性、高分辨率活体成像因埋藏于软组织中的周围神经光学不可及仍是重大技术挑战。本研究提出一种广泛适用的小鼠周围神经纵向高分辨率光学活体成像方法，结合柔性光学透明聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane, PDMS)窗口与多模态显微镜。PDMS窗口植入小鼠坐骨神经(Nervus ischiadicus)上方皮肤，提供稳定、耐受肢体运动的 optical access 超过一个月且不损害神经功能。利用共聚焦(confocal)、双光子(two-photon)及二次谐波产生(Second-Harmonic Generation, SHG)显微镜，研究人员同时以高时空分辨率可视化荧光标记的轴突(axons)与施万细胞(Schwann cells, SCs)、内源性胶原(collagen)及血管系统。该方法可实时追踪多种神经损伤模型下的轴突退变(degeneration)与再生(regeneration)、施万细胞动态及细胞外基质(extracellular matrix, ECM)引导的轴突寻径(pathfinding)。该平台亦支持临床相关的神经切断间隙修复模型中轴突再生的纵向成像。总之，本方法为体内研究周围神经生物学及检测再生疗法开辟了新途径。

论文解读：《利用光学窗口植入体对小鼠周围神经损伤反应进行纵向单轴突分辨率活体成像》

研究背景与意义

周围神经损伤(Peripheral Nerve Injury, PNI)年影响人数超10万（仅美国），可导致感觉、运动及自主神经功能障碍甚至长期残疾。目前深部成像手段如磁共振成像(MRI)和超声空间分辨率不足以可视化单个轴突等微小解剖特征，且缺乏特异性细胞及组织成分对比剂；传统光学方法因皮肤和肌肉散射在深区成像受限。脑与脊髓已成功应用组织嵌入光学窗口(optical window)进行长期成像，但周围神经缺乏骨性支撑、埋于高度活动的软组织和肌肉中，既往刚性植入物易移位、造成压迫或诱发纤维化，导致纵向高分辨率活体成像难以实现。为此，研究人员开发了一种基于柔性聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane, PDMS)皮肤嵌入窗口的小鼠坐骨神经活体成像平台，以实现数周至数月尺度上单轴突分辨率的纵向观察，相关成果发表于《Advanced Science》。

主要关键技术方法

研究人员选用Thy1-YFP（标记神经元轴突）、Thy1-GCaMP及S100-GFP（标记施万细胞Schwann cells, SCs）转基因小鼠，部分实验辅以尼罗红(Nile Red)原位标记髓鞘(myelin)、尾静脉注射DyLight-649-番茄凝集素(tomato lectin)标记血管内皮。手术分离股二头肌显露坐骨神经后，将柔性透明PDMS窗口植入并缝合固定于皮肤切口处封闭创口；部分实验建立部分挤压(crush)、压迫(compression)、切断伴导管(conduit)修复等多种损伤模型。活体成像采用单光子(1P)共聚焦、双光子(2P)激光扫描显微镜及二次谐波产生(Second-Harmonic Generation, SHG)模式获取z-stack图像，经最大强度投影(Maximum Intensity Projection, MIP)及三维重建处理；辅以步态错步测试(foot fault test)、肌力和复合肌肉动作电位(Compound Muscle Action Potential, CMAP)电生理检测及组织学验证。

研究结果

2.1 Hindlimb Skin-Embedded PDMS Window Enables Long-Term Sciatic Nerve Imaging（后肢皮肤嵌入PDMS窗口实现长期坐骨神经成像）

研究人员将PDMS窗口植入小鼠后肢皮肤覆盖坐骨神经区域，中位留存时间约7周（90%维持≥18天，12%＞80天），显著优于刚性3D打印丙烯酸植入物（中位9天）。行为学网格行走测试、3个月后腓肠肌与胫骨前肌肌力及CMAP均在正常范围，组织学显示植入90天后轴突密度与直径与对侧无差异。Thy1-YFP小鼠中同一区域个体轴突可在24天内重复追踪，证实窗口不干扰神经功能并提供稳定光学通路。

2.2 High-Resolution Multimodal and Dynamic Imaging of Peripheral Nerve Structures（周围神经结构的高分辨率多模态及动态成像）

结合Thy1-YFP/S100-GFP荧光信号、Nile Red标记髓鞘脂质、SHG内源信号（胶原与弹性蛋白）及番茄凝集素标记血管，利用1P与2P共聚焦及SHG同步采集，实现对轴突、SCs、髓鞘、胶原基质、血管及部分脂肪细胞的多通道亚细胞分辨率成像，并可动态追踪血流等快速生理过程。

2.3 Visualization of Acute Injury Response Shows SCs Motility and Rapid Loss of GFP/YFP Signal in Injured Fibers（急性损伤反应可视化显示施万细胞运动性及损伤纤维中GFP/YFP信号快速丢失）

部分挤压损伤后15–30分钟内S100-GFP⁺施万细胞质回缩、形态改变且GFP信号显著降低；Thy1-YFP小鼠中损伤远端轴突YFP信号于1–2天减退（华勒变性Wallerian degeneration），第4天可见生长锥(growth cone)样再生轴突沿残存神经内膜管(endoneurial channels)延伸，估算再生速率≥1 mm/天，符合小鼠坐骨神经已知再生速度。

2.4 Axonal Degeneration and Regrowth in Compression Injury With Localized Epineurial Disruption（伴局限性神经束膜破坏的压迫损伤中轴突退变与再生长）

压迫损伤致轴突YFP信号丢失但神经内膜胶原（SHG）与Nile Red标记髓鞘相对保留；第6天再生轴突沿残存神经内膜管走行，偶见偏离进入神经束膜(epineurium)缺损区；术后34天可见Nile Red阳性再髓鞘化轴突，证明窗口可观察完整再生与重塑过程及ECM导向作用。

2.5 Visualization of Nerve Repair Across a Conduit in a Transection Model（横断模型经导管神经修复的可视化）

完全切断坐骨神经并以PDMS半管导管修复（2.5 mm间隙），窗口下连续观察显示：术后早期导管内迁入游走YFP⁺细胞，第25天见束状再生轴突跨越间隙沿导管轴排列，第35天密度增加；59天远端组织学证实有髓再生轴突，5/6例观察到荧光再生信号及功能恢复迹象。

讨论与结论总结

讨论指出，该柔性PDMS皮肤窗口顺应肢体运动、低免疫原性、高透光且折射率接近生物组织，克服了既往刚性窗口易脱落与压迫神经的缺陷，可与多模态显微镜联用实现轴突、SCs、髓鞘、胶原及血管的多重标记无标记同步成像。局限包括成像深度受组织散射限于神经最表浅约5%–30%体积、2–3周后窗口内侧形成纤维膜影响对比度（可通过端口清除部分缓解）、Thy1与S100报告基因存在少量非目标细胞表达、Nile Red潜在影响未系统评估、功能与样本量属补充观察等。该技术可纵向追踪同一动物同区域神经从急性期SCs表型转换、轴突片段化到再生萌芽及ECM导向全过程，亦可应用于导管移植评估，未来可通过抗纤维化涂层、自适应光学、三光子激发及近红外探针进一步优化。

结论部分翻译：研究人员建立的坐骨神经窗口技术提供了一个稳定、微创的平台，可在损伤与修复过程中对周围神经细胞行为进行纵向高分辨率可视化。该技术无需额外手术创伤即可对同一神经区域重复成像，较传统离体(ex vivo)方法具显著优势，有助于详细表征施万细胞迁移、轴突退变与再生及沿神经内膜管导向等关键过程。实时监测这些事件为阐明周围神经疾患机制及研究损伤修复生物学开辟新途径。尽管存在一定技术局限，本模型为体内活体(intravital)研究建立了通用且可拓展的框架，进一步完善后有望推动周围神经生物学的基础与转化研究。