小鼠视网膜中的A2无长突细胞通过突触与α神经节细胞相连

《Vision Research》：A2 amacrine cell output synapses to alpha ganglion cells in the mouse retina

　　

朱永龄|乔安德鲁|庞吉杰|吴塞缪尔·M

美国伊利诺伊州芝加哥市西北大学费因伯格医学院眼科与神经科学系

摘要

A2型无长突细胞是哺乳动物视网膜中最重要的无长突细胞，因为它们是内层视网膜中整合视杆细胞和视锥细胞信号的“枢纽”，并将这些信号分别传递到兴奋型神经节细胞和抑制型神经节细胞通路。然而，目前尚不清楚A2型无长突细胞是否将其信号传递给哺乳动物视网膜中的所有类型的神经节细胞。造成这一知识空白的主要原因是难以在不刺激其他视网膜神经元的情况下选择性激活A2型无长突细胞。在本研究中，我们利用一种新开发的鼠类视网膜标本，通过玻璃体注射携带ACAGW-ChR2-Venus基因构建的AAV2型病毒（Addgene 20,071），使通道视紫红质（ChR2 [H134R]-Venus融合蛋白）在A2型无长突细胞中选择性表达。我们找到了一个特定的浓度范围，在该范围内ChR2仅在A2型无长突细胞中表达，而不在其他细胞中表达，同时仍能观察到由ChR2引发的明显突触后信号。我们研究了ChR2引发的A2型无长突细胞去极化对四种类型α神经节细胞的影响，即兴奋型持续型αRGC、抑制型持续型αRGC、兴奋型短暂型αRGC以及抑制型短暂型αRGC，结果发现A2型无长突细胞去极化分别通过A2型无长突细胞-视锥细胞DBC_R/MC间隙连接通路和A2型无长突细胞-抑制型αRGC甘氨酸能通路来介导这两种类型的α神经节细胞反应。而A2型无长突细胞去极化并未影响兴奋型短暂型αRGC和抑制型短暂型αRGC的反应，后两者的反应可能由其他类型的无长突细胞介导。这些实验表明，A2型无长突细胞去极化可介导部分兴奋型和抑制型神经节细胞的反应，这说明任何单一类型的视网膜神经元信号都参与到了与视网膜输出通路相关的特定细胞类型电路中。

引言

A2型无长突细胞是哺乳动物视网膜中最丰富的无长突细胞（MacNeil & Masland, 1998; Strettoi & Masland, 1996）。这类具有窄感受野的甘氨酸能无长突细胞是内层视网膜中整合视杆细胞和视锥细胞信号的“枢纽”。解剖学研究显示，哺乳动物的视杆细胞双极细胞并不直接与神经节细胞形成突触，而是与A2型无长突细胞形成谷氨酸能突触，随后A2型无长突细胞通过间隙连接将视杆细胞信号传递给兴奋型视锥细胞双极细胞，再由后者将信号传递给兴奋型神经节细胞（Masland, 2001; Pang, 2007; Trexler et al., 2001）。此外，A2型无长突细胞还会与抑制型双极细胞及抑制型神经节细胞形成甘氨酸能突触，从而使这些细胞产生信号反向的抑制型反应（Wassle et al., 2009）。由于哺乳动物视网膜中有超过40种类型的神经节细胞（Baden et al., 2016），目前尚不清楚是否所有类型的神经节细胞都会接收来自A2型无长突细胞的信号，还是仅有部分类型的神经节细胞会接收到此类信号。造成这一知识空白的主要原因在于，在光刺激过程中很难选择性激活A2型无长突细胞而不影响其他视网膜神经元，如视杆细胞和视锥细胞。在本研究中，我们使用了另一种新开发的鼠类视网膜标本，通过玻璃体注射携带ACAGW-ChR2-Venus基因构建的AAV2型病毒，使通道视紫红质在A2型无长突细胞中选择性表达（Addgene 20,071）。我们找到了一个特定的浓度范围，在该范围内ChR2仅在A2型无长突细胞中表达。我们研究了ChR2引发的A2型无长突细胞去极化对四种类型α神经节细胞的影响。之所以选择研究α神经节细胞，是因为在记录过程中，由于其细胞体较大，它们是平铺式视网膜中最容易识别的神经节细胞。此外，在Kcng4: Cre转基因小鼠（Jax品系/029414）中，还可以通过其荧光细胞体在视觉引导下识别出小鼠的α神经节细胞（Krieger et al., 2017）。我们在使用了能够消除所有视网膜神经元中由视杆细胞和视锥细胞介导的光反应的药物抑制剂后，记录了A2型无长突细胞去极化引发的这四种类型α神经节细胞的反应。此时仅剩下由A2型无长突细胞中的ChR2引发的去极化所导致的反应。通过这种方式，我们发现兴奋型持续型α神经节细胞是由A2型无长突细胞驱动的，而兴奋型短暂型α神经节细胞则不是，这说明由A2型无长突细胞整合的视杆细胞和视锥细胞信号仅存在于部分类型的神经节细胞中。

章节节选

实验材料准备

本研究使用了野生型小鼠（C57BL/6 J，JAX编号000664，年龄为6-12周），偶尔也使用Kcng4转基因小鼠（Krieger et al., 2017）。实验中使用了雄性和雌性小鼠。所有动物的处理均遵循贝勒医学院关于实验动物管理的政策，同时也符合ARVO关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明以及NIH关于实验动物使用的指南。在进行实验之前，小鼠需在黑暗环境中适应1–2小时。

实验结果

为了选择性激活A2型无长突细胞，我们将AAV2-ACAGW-ChR2-Venus病毒（见图1A）注入小鼠的眼睛。图1B显示了无长突细胞层中同时被通道视紫红质（绿色）和仅能标记小鼠视网膜中A2型无长突细胞细胞体的Prox1抗体（红色）双重标记的细胞体（Perez de Sevilla et al., 2017）。我们发现，在特定的浓度范围内，AAV2-ACAGW-ChR2-Venus仅能标记A2型无长突细胞，即ChR2仅在这些细胞中表达，而在其他细胞中不表达。

讨论

本研究通过光遗传学技术得到的结果与之前研究中的A2型无长突细胞-α神经节细胞突触回路示意图一致（参见Wu & Pang, 2024中的图2）。图3展示了该示意图的修改版本，其中呈现了小鼠视网膜中四种类型α神经节细胞所接收的视杆细胞和视锥细胞突触输入的局部结构，可见A2型无长突细胞在介导兴奋型持续型α神经节细胞反应中起着核心作用。图2A表明，A2型无长突细胞去极化可以激活A2型无长突细胞-DBC_R/MC-兴奋型持续型αRGC通路。

CRediT作者贡献说明

朱永龄：论文撰写——初稿撰写，研究指导，资源提供，项目管理，方法设计，实验实施，资金筹集，正式数据分析，数据整理，概念构思。乔安德鲁：结果验证，软件应用，方法设计，实验实施，正式数据分析，数据整理。庞吉杰：软件应用，资源提供，方法设计，实验实施，正式数据分析，数据整理。吴塞缪尔·M：论文撰写——审阅与编辑，论文撰写——初稿撰写，结果可视化，结果验证，研究指导，软件应用。

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢

本项研究得到了以下机构的资助：NIH（R01 EY004446、R01 EY019908、R01 EY033492、R01 EY030169、R01 EY018204、R01 EY032506）、NIH视觉核心项目（P30 EY 02520）、休斯顿视网膜研究基金会、预防失明研究组织以及LC工业基金会。