6PPD-醌（6PPD-Quinone）和TiO2纳米颗粒（TiO2 NPs）暴露下双壳贝类的微生物群相关肠道损伤

《Water Biology and Security》：Microbiota-associated intestinal injury in bivalves exposed to 6PPD-Quinone and TiO2 nanoparticles

　　

新兴污染物如6PPD-醌（6PPD-Quinone, 6PPD-Q）和二氧化钛纳米颗粒（TiO₂ Nanoparticles, TiO₂ NPs）在水生环境中被频繁检出，但其对海洋双壳贝类的联合效应尚不清楚。研究人员在受控实验室条件下，将厚壳贻贝（Mytilus coruscus）暴露于6PPD-Q（1和10 μg/L）、TiO₂ NPs（0.1 mg/L）单独及联合处理（Mix Low：1 μg/L 6PPD-Q + 0.1 mg/L TiO₂；Mix High：10 μg/L 6PPD-Q + 0.1 mg/L TiO₂）14天。与单独处理相比，联合暴露引发了更显著的氧化应激，表现为超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）、过氧化氢酶（Catalase, CAT）和丙二醛（Malondialdehyde, MDA）水平升高。组织中6PPD-Q浓度范围为0.0023–0.0518 μg/g，TiO₂为0.0468–0.344 μg/g，混合暴露下积累量更高。此外，包括淀粉酶（AMS）、脂肪酶（LPS）、溶菌酶（LZM）、胃蛋白酶（PS）和胰蛋白酶（TRS）在内的消化酶活性显著改变，表明肠道消化功能受损，尤其在联合暴露条件下。转录分析显示促炎细胞因子（肿瘤坏死因子-α, TNF-α和白细胞介素-17, IL-17）上调，伴随Bcl-2表达降低及Caspase-3和Caspase-8水平升高，提示凋亡相关通路激活。高通量16S rRNA测序显示肠道微生物组成发生显著改变，表现为蓝细菌门（Cyanobacteriota）减少和变形菌门（Proteobacteria）富集，表明微生物群失调。与这些分子和微生物变化一致，组织病理学检查显示肠道病变加剧，包括上皮细胞空泡化，尤其在混合暴露组。这些结果表明，6PPD-Q和TiO₂ NPs的联合暴露与厚壳贻贝肠道氧化应激增强、炎症和凋亡反应激活以及肠道微生物群失衡相关。该研究首次提供了6PPD-Q相关暴露情景与海洋双壳贝类肠道损伤关联的证据，并强调了轮胎衍生化学品与工程纳米颗粒在沿海生态系统中相互作用的潜在生态风险。

近年来，随着工业化进程加速和城市化扩张，水生生态系统持续受到多种人为污染物的威胁。轮胎磨损化学品作为新兴污染物受到全球关注，其中6PPD-醌（6PPD-Quinone, 6PPD-Q）是轮胎防老化剂6PPD的臭氧转化产物，已在世界多地水体中被广泛检出，其环境浓度与多种鱼类的急性致死效应密切相关。与此同时，二氧化钛纳米颗粒（TiO₂ Nanoparticles, TiO₂ NPs）作为工程纳米材料，因其在涂料、化妆品、食品添加剂等领域的广泛应用，持续通过工业和生活污水排入水生环境。在沿海城市环境中，这两类污染物常共存于地表径流和污水排放中，形成真实的联合暴露情景。双壳贝类作为高效的滤食性生物，易积累和富集纳米颗粒及化学污染物，是理想的水生生物指示种。厚壳贻贝（Mytilus coruscus）因其对环境胁迫的高敏感性，成为评估新兴污染物生态风险的有效模式生物。尽管已有研究分别探讨了6PPD-Q和TiO₂ NPs对水生生物的毒性效应，但二者联合作用对海洋贝类肠道功能及微生物群相关机制的影响尚不明确。基于此，研究人员设计并实施了这项研究，旨在系统评估6PPD-Q和TiO₂ NPs单独及联合暴露对厚壳贻贝肠道健康的影响，为理解轮胎衍生化学品与工程纳米颗粒在沿海生态系统中的相互作用及其生态风险提供 mechanistic insight（机制性见解）。该论文发表于《Water Biology and Security》。

研究关键技术方法包括：实验动物采自中国浙江省舟山市枸杞岛海域的厚壳贻贝；污染物暴露采用6PPD-Q和TiO₂ NPs单独及联合处理，设置14天暴露期和7天恢复期；生物积累量检测采用电感耦合等离子体质谱（Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry, ICP-MS）测定TiO₂，液相色谱-串联质谱（Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry, LC-MS/MS）测定6PPD-Q；组织病理学分析采用苏木精-伊红（Hematoxylin and Eosin, H&E）染色；消化酶和氧化应激生物标志物测定采用商业试剂盒；肠道微生物群分析采用16S rRNA V3-V4区高通量测序，在Illumina NovaSeq 6000平台上进行，后续进行扩增子序列变异（Amplicon Sequence Variants, ASVs）分析、α多样性计算及线性判别分析效应大小（Linear Discriminant Analysis Effect Size, LEfSe）分析；炎症和凋亡相关基因表达采用定量实时PCR（Quantitative Real-Time PCR, qRT-PCR）检测；分子对接采用AutoDock Vina软件评估6PPD-Q与Caspase-3和Bcl-2蛋白的潜在结合；数据统计采用三因素方差分析和主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）等方法。

**生物积累与急性毒性**

SEM和TEM显示TiO₂为球形锐钛矿相纳米颗粒，DLS测得流体动力学粒径约1800–1900 nm，Zeta电位为?12 mV。暴露14天后，6PPD-Q和TiO₂均在厚壳贻贝肠道中呈浓度依赖性积累，混合暴露组积累量更高。6PPD-Q在肠道中的浓度从1 μg/L组的0.003716 μg/g升至10 μg/L组的0.04429 μg/g，混合高剂量组达0.051823 μg/g；TiO₂单暴露组为0.286 μg/g，混合低剂量和高剂量组分别为0.294 μg/g和0.308 μg/g。急性毒性试验显示，厚壳贻贝对6PPD-Q的敏感性远高于TiO₂，96小时半致死浓度（LC₅₀）分别为1000 μg/L和20 mg/L，相差约两个数量级。

**消化酶与抗氧化酶响应**

消化酶和抗氧化酶活性在暴露后发生显著变化。暴露7天后，淀粉酶（Amylase, AMS）和脂肪酶（Lipase, LPS）活性在6PPD-Q高剂量组和TiO₂组受到显著抑制，混合高剂量组抑制最为严重，14天时进一步下降，恢复期内AMS完全恢复而LPS部分恢复。溶菌酶（Lysozyme, LZM）活性在所有处理组于7天时显著升高，混合高剂量组达到峰值，该增强效应持续至14天并在恢复期恢复正常。胃蛋白酶（Pepsin, PS）和胰蛋白酶（Trypsin, TRS）活性持续下调，14天时混合高剂量组抑制最强，恢复期PS部分恢复、TRS完全恢复。抗氧化方面，过氧化氢酶（Catalase, CAT）活性在混合高剂量组于7天和14天均显著升高，恢复期恢复至对照水平；丙二醛（Malondialdehyde, MDA）水平急剧上升，混合高剂量组诱导最强且恢复期仍维持升高；超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）活性在各组显著上调，混合高剂量组尤为明显，恢复期重新平衡至基线水平，反映氧化应激反应的时序性特征。

**肠道微生物群失调**

组织病理学结果显示，6PPD-Q、TiO₂单独及联合暴露均导致肠道上皮空泡化增加，联合暴露组病变尤为严重，混合高剂量组组织病理学评分最高（4.2±0.1），显著高于对照组（0.3±0.1）。微生物群分析显示，各处理组共享119个核心ASVs。Circos分析表明，对照组以蓝细菌门（Cyanobacteriota）和norank_o__Chloroplast为主，而高剂量6PPD-Q和混合暴露组则向变形菌门（Proteobacteria）、Nesterenkonia、Dietzia和弧菌属（Vibrio）等机会性菌群转变。PCoA分析显示处理组间微生物群落存在明显聚类差异，第一和第二主成分分别解释66.76%和15.75%的变异。α多样性指数显示处理组间存在显著变化：Chao1丰富度在高剂量6PPD-Q组降低、混合高剂量组波动较大；Shannon多样性在高剂量6PPD-Q组轻微增加但在混合高剂量组下降；Simpson均匀度在高剂量6PPD-Q组和混合低剂量组降低。

门水平和属水平的群落组成分析显示显著的结构改变。门水平上，对照组以蓝细菌门为优势菌群（45%），变形菌门为次要组分；暴露后蓝细菌门显著减少，拟杆菌门（Bacteroidota）和厚壁菌门（Firmicutes）增加，联合暴露下变形菌门成为优势菌群。属水平上，对照组呈现均衡的微生物群落，污染物暴露导致群落组成显著偏移，TiO₂和联合暴露组富集了假单胞菌属（Pseudomonas）和不动杆菌属（Acinetobacter）等潜在致病菌，而高剂量6PPD-Q单独暴露则促进了拟杆菌门相关属的增殖。共现网络分析显示，6PPD-Q暴露重塑了肠道微生物互作关系，增加了正相关比例、减少负相关，核心节点包括Psychrobacter、Acinetobacter、Shewanella和Pseudomonas；联合暴露网络则呈现更紧凑、密集连接的拓扑结构，Bacteroides、Marinobacter、Psychrobacter和Acinetobacter主要通过正相关连接，网络复杂性和中心化程度较单独6PPD-Q暴露更高。LEfSe分析识别出各处理组特异的微生物标志物，混合暴露组尤其高剂量混合组显示出最多且效应量最大的富集分类单元，主要隶属于变形菌门、拟杆菌门和放线菌门（Actinobacteriota），包括Ancylomarina、Bacteroides、Vibrio、Tenacibaculum、Mycoplasma和Psychrobacter等属。

**炎症与凋亡相关响应**

炎症和凋亡基因表达分析显示显著的处理效应。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-17（IL-17）在6PPD-Q高剂量组、TiO₂组及两个混合组均显著上调，混合高剂量组诱导最强。抗凋亡基因Bcl-2在6PPD-Q高剂量组、TiO₂组及混合组显著下调，而Caspase-3和Caspase-8显著上调，呈现从单因素到联合处理的剂量依赖性增强。分子对接分析预测6PPD-Q可能与Caspase-3和Bcl-2存在结合作用，预测结合能分别为?7.4和?7.2 kcal/mol，为6PPD-Q与凋亡相关蛋白的潜在相互作用提供了计算模拟支持。

**多变量综合分析**

综合生物标志物响应（Integrated Biomarker Response, IBR）星图显示，多边形沿炎症/氧化和凋亡轴扩展，沿消化轴收缩，表明功能权衡随剂量升高和混合暴露而加剧，IBR值随污染物浓度增加而升高，恢复期部分趋近对照但未能完全恢复。PCA分析解释了95.3%的方差，PC1（90.0%）将6PPD-Q高剂量和混合高剂量组与对照/6PPD-Q低剂量分离，PC2（5.3%）区分TiO₂/混合低剂量与6PPD-Q处理组。IL-17、TNF-α、CAT、SOD、MDA、Caspase-3和Caspase-8沿PC1增加，而AMS、LPS、PS、TRS、LZM和Bcl-2降低。Pearson相关热图显示消化酶组内高度正相关（r≈0.90–0.97），并与促炎因子和半胱天冬酶负相关（r≈?0.85至?0.98）；SOD与CAT及细胞因子正相关（如SOD-TNF-α/IL-17 r≈0.90–0.94）；Bcl-2与消化酶中等正相关（r≈0.57–0.77），但与细胞因子负相关（r≈?0.85至?0.90）；Caspase-3与Caspase-8紧密跟踪（r≈0.93–0.96）。

讨论部分，研究人员将上述发现置于双壳贝类特有的生理背景下进行阐释。贝类消化过程大量发生在消化盲管内的细胞内，延长了消化上皮细胞与颗粒污染物的接触时间；同时贝类缺乏适应性免疫，主要依赖先天免疫防御，这使得肠道损伤更可能由氧化应激、上皮损伤和先天免疫激活驱动。研究中6PPD-Q的96小时LC₅₀（1000 μg/L）远高于鲑鱼类的急性致死浓度，体现了显著的物种特异性敏感性差异。联合暴露导致污染物在肠道中积累增加，表明纳米颗粒可能通过加成或协同作用增强有机污染物的摄取。消化酶的抑制模式（AMS和LPS受抑、LZM升高）反映了消化功能障碍与免疫激活的并存，这种代偿性激活可能从消化和生长中分流代谢能量，导致系统性能量应激。抗氧化酶的上调未能阻止持续的脂质过氧化损伤，MDA在恢复期仍维持升高，提示膜损伤修复延迟，存在亚致死但持久性的生理损害风险。TNF-α和IL-17的协同上调代表了跨分类群的保守炎症机制，将污染物诱导的氧化应激与免疫失调相联系。Caspase-8/Caspase-3的上调与Bcl-2的下调表明内源性和外源性凋亡通路均被激活。肠道微生物群的变化，特别是蓝细菌门的减少和变形菌门的富集，构成了典型的菌群失调模式，变形菌门作为革兰氏阴性菌富含脂多糖（LPS），其增殖可能刺激Toll样受体-核因子κB（TLR-NF-κB）信号通路，进而增强TNF-α和IL-17表达及炎症反应。微生物网络复杂性的增加可能降低菌群生态恢复力，加剧宿主肠道应激和炎症。组织病理学上，联合暴露导致的肠道空泡化和结构损伤最为严重，与微生物群落改变高度一致。需要指出的是，微生物群失调与肠道损伤之间的因果关系尚不明确：菌群变化可能促进炎症和代谢紊乱，而污染物诱导的上皮损伤也可能选择性地富集机会性菌群，菌群失调可能同时作为肠道功能障碍的驱动因素和后果。

研究结论：该研究表明，6PPD-Q或纳米TiO₂单独暴露即可破坏厚壳贻贝的肠道氧化还原平衡并改变肠道微生物组成。联合暴露引发更为显著的肠道损伤，特征为氧化应激加剧、炎症和凋亡激活增强以及更严重的微生物群失调。单因素与联合处理的比较分析表明，混合暴露对肠道稳态的干扰程度大于单独污染物。尽管肠道微生物群和肠道完整性的改变可能具有更广泛的生理学意义，但本研究主要强调了与微生物群相关的肠道毒性，而非对神经毒性或行为的直接影响。总体而言，研究结果强调了在生态风险评估中考虑新兴污染物混合效应的重要性，并为共存化学胁迫因子如何加剧海洋双壳贝类肠道功能障碍提供了机制性见解。