整合单细胞、群体及空间转录组学揭示肺腺癌新型核糖体生物发生相关预后模型并将RPS19BP1定义为促癌调控因子

《International Journal of Molecular Sciences》：Integrating Single-Cell, Bulk, and Spatial Transcriptomics Unveils a Novel Ribosome Biogenesis-Related Prognostic Model and Defines RPS19BP1 as a Pro-Oncogenic Regulator in Lung Adenocarcinoma

　　

核糖体生物发生（ribosome biogenesis)的异常调控日益被认为是肿瘤恶性化的标志之一，但其在肺腺癌(lung adenocarcinoma, LUAD)中的预后意义尚未完全阐明。该研究旨在构建一个LUAD核糖体生物发生相关预后模型并探索其与肿瘤免疫微环境(tumor immune microenvironment, TME)的潜在关联。研究人员整合单细胞及群体RNA测序(RNA-seq)数据以识别核糖体生物发生相关基因(ribosome biogenesis-related genes, RBRGs)，继而通过Cox回归、最小绝对收缩和选择算子(Least Absolute Shrinkage and Selection Operator, LASSO)回归及多变量Cox分析建立预后风险评分，并在两个独立的GEO队列中进行验证。研究人员系统评估了风险评分与肿瘤突变负荷(tumor mutational burden, TMB)、免疫浸润及计算推断免疫治疗反应之间的关联。此外，研究人员通过体外实验表征了模型关键基因RPS19BP1的生物学功能。该研究共识别出262个RBRGs，所构建的14基因风险评分在三个队列中均显示出预后价值[TCGA：1、2、3年曲线下面积(area under the curve, AUC)分别为73.08、72.44、72.20；GSE68571：1、2、3年AUC分别为67.93、73.24、77.59；GSE8894：1、2、3年AUC分别为75.56、72.99、71.77]。低风险组表现出更具免疫活性的肿瘤微环境，而高风险组则与免疫抑制表型相关。RPS19BP1敲低显著减弱了LUAD细胞的增殖、迁移和侵袭能力。该多组学来源的预后模型在回顾性LUAD队列中显示出预后潜力，与不同的免疫浸润模式相关，并将RPS19BP1确定为LUAD中的促癌调控因子。

## 一、研究背景与目的

肺癌是全球最常见的恶性肿瘤，2022年约有250万新发病例和180万癌症相关死亡，给社会带来沉重负担和经济损失。在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)中，肺腺癌(lung adenocarcinoma, LUAD)是最常见的亚型之一。尽管放疗、化疗和手术切除等传统疗法已较为成熟，但其疗效受生物利用度差、药物耐药率高以及晚期LUAD患者肿瘤复发率高等因素限制。近年来，随着对LUAD不同分子亚型异质性及肿瘤微环境(tumor immune microenvironment, TME)可塑性理解的深入，免疫检查点阻断(immune checkpoint blockade, ICB)疗法这一个性化治疗方法在一定程度上改善了LUAD患者的预后。然而，并非所有LUAD患者都能从免疫治疗中获益，因此准确预测LUAD患者预后并精准识别最可能从免疫治疗中获益的患者成为亟待解决的临床挑战。

核糖体生物发生(ribosome biogenesis)是一个精确调控且高度复杂的生物学过程，涵盖rRNA转录、加工和修饰以及核糖体组装和前核糖体输出等环节。该过程涉及大量组装和成熟因子，其活性受多种细胞信号通路调控。越来越多的证据表明，核糖体丰度增加和核糖体修饰改变与多种癌症的发生发展密切相关。SOD1可通过上调核糖体生物发生促进KRAS驱动的NSCLC进展；核糖体生物发生因子(ribosome biogenesis factors, RBIS)与LUAD进展密切相关并代表潜在治疗靶点。然而，核糖体生物发生对LUAD增殖、侵袭和免疫浸润的影响尚未完全阐明。

随着分子生物学技术的进步，单细胞RNA测序(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)克服了传统群体RNA测序的固有局限性，能够在单细胞分辨率下进行转录组分析，揭示组织内的细胞异质性并精确表征不同细胞亚群。在肿瘤学领域，scRNA-seq已成为研究TME、识别新型分子亚型、发现潜在治疗靶点和定义预后生物标志物的关键技术。与之互补的是，空间转录组学(spatial transcriptomics)技术能够在完整组织切片中测量转录本丰度同时保留真实空间坐标，直观展示基因表达模式和细胞群体的物理分布。在癌症研究中，这一方法已成为探究细胞亚群间通讯和评估肿瘤免疫浸润程度的重要工具。因此，整合scRNA-seq和空间分析技术对于识别LUAD关键生物标志物、表征其表达图谱、预测治疗反应和患者预后具有重要前景。

基于此，研究人员利用scRNA-seq数据识别LUAD标本中的不同细胞类型，系统表征这些细胞群体的核糖体生物发生活性水平，在此基础上整合群体RNA-seq数据构建能够准确预测LUAD患者预后的风险评分和预后模型，并探索其与免疫治疗反应的潜在相关性。同时，研究人员对关键基因RPS19BP1进行深入分析，聚焦其在肺癌细胞中的潜在生物学功能，首次通过体外功能实验验证了RPS19BP1在LUAD中的致癌作用。该研究成果发表于《International Journal of Molecular Sciences》。

## 二、关键技术方法

研究主要涉及以下核心技术方法：数据来源于GSE131907数据库（11对LUAD及癌旁正常肺组织scRNA-seq数据）、TCGA-LUAD队列（495例）、GEO数据库的GSE68571（86例）、GSE8894（63例）及GSE135222（27例抗PD-1/PD-L1治疗NSCLC队列）；从分子特征数据库(Molecular Signatures Database, MSigDB)获取GOBP_RIBOSOME_BIOGENESIS.v2023.2.Hs基因集。技术流程包括：Seurat包进行scRNA-seq质控、降维、聚类和细胞注释；AUCell算法计算单细胞核糖体生物发生活性评分；LASSO回归、单变量及多变量Cox回归构建14基因预后风险模型；timeROC评估预测效能；TIDE算法、CIBERSORT、ESTIMATE、MCP-counter等多种算法评估免疫浸润及免疫治疗反应；10× Genomics Visium空间转录组平台分析RPS19BP1与核糖体生物发生活性的空间共定位；Monocle2进行拟时序轨迹分析；CellChat分析细胞间通讯；Western blot、CCK-8、EdU融入实验、克隆形成实验、划痕愈合实验及Transwell实验等体外功能实验验证RPS19BP1的促癌作用。

## 三、研究结果

**单细胞转录组分析与RBRGs识别**：研究人员从GEO数据库获取11对肺癌及相邻正常肺组织样本（GSE131907），经严格质控保留86,556个高质量细胞。通过主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)和均匀流形近似与投影(Uniform Manifold Approximation and Projection, UMAP)降维，细胞被划分为32个亚群，进而精确注释为11种不同细胞类型，包括上皮细胞、间皮细胞、成纤维细胞、肥大细胞、髓系细胞、NK细胞、浆细胞、B细胞、平滑肌细胞、T细胞和增殖期细胞。AUCell算法评估显示，LUAD组织样本的整体AUC评分及大多数细胞类型的AUC评分均高于正常肺组织样本，提示LUAD组织中核糖体生物发生活性上调。以中位AUC评分为阈值，将AUCell高分组与低分组比较，提取与AUC评分最相关的前100个基因，并与高AUCell评分组中上调的差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)取并集，最终获得262个RBRGs。KEGG和GO富集分析显示RBRGs显著富集于核糖体加工相关通路。

**预后风险评分模型的构建与验证**：在262个RBRGs中，255个基因在TCGA-LUAD表达矩阵中被检测到。经单变量Cox回归初步识别124个与预后显著相关的候选基因，LASSO回归进一步筛选出27个非零系数基因，最终多变量Cox回归确定14个核心预后相关RBRGs及其模型系数。风险评分公式为：risk score = 0.143 × GPRC5A + 0.195 × LGALS3 ? 0.175 × CD9 + 0.179 × TM4SF1 ? 0.093 × GDF15 ? 0.083 × WFDC2 ? 0.106 × HLA-DRB5 ? 0.457 × VAMP8 + 0.331 × TIMP1 + 0.172 × CSTB ? 1.827 × CD68 + 0.233 × XRCC5 + 0.392 × RPS19BP1 + 0.409 × MALSU1。以TCGA-LUAD为训练集，GSE68571和GSE8894为验证集，Kaplan-Meier生存分析显示高风险组患者总生存期(overall survival, OS)显著更短（TCGA: p = 3 × 10^?9；GSE68571: p = 0.0072；GSE8894: p = 1 × 10^?4）。timeROC分析表明模型预测效能良好，C-index分别为0.699、0.705和0.689。校准曲线和决策曲线分析(decision curve analysis, DCA)进一步证实该模型具有潜在临床应用价值。单变量和多变量Cox回归显示风险评分具有独立预后价值，并构建了整合T分期、N分期和风险评分的列线图(nomogram)。

**风险评分的突变图谱与免疫特征**：TCGA-LUAD队列中，高风险组的TP53、TTN、CSMD3、MUC16、RYR2、ZFHX4、KRAS、USH2A、LRP1B、SPTA1、XIRP2和FLG等基因突变频率高于低风险组，风险评分与TMB呈正相关。肿瘤免疫功能障碍与排除(Tumor Immune Dysfunction and Exclusion, TIDE)分析显示，TIDE算法推断为非应答者的患者风险评分显著更高（p = 7.5 × 10^?7）。低风险组在所有四种免疫状态类别中的免疫表型评分(immunophenoscore, IPS)均高于高风险组。GSE135222免疫治疗队列中，低风险组无进展生存期(progression-free survival, PFS)呈延长趋势但未达统计学显著性（p = 0.12）。免疫检查点基因表达比较显示，绝大多数抑制性免疫检查点基因和共刺激分子基因在低风险组表达显著更高。五种算法评估免疫浸润的结果一致表明：CIBERSORT算法显示低风险组CD8⁺ T细胞、记忆B细胞、静止肥大细胞和静止树突状细胞浸润水平更高；ESTIMATE算法显示低风险组基质评分、免疫评分和ESTIMATE评分显著升高，而高风险组肿瘤纯度评分更高，呈典型"免疫冷肿瘤"表型；MCP-counter算法显示T细胞、CD8⁺ T细胞、细胞毒性淋巴细胞、NK细胞、B谱系细胞和髓系树突状细胞在低风险组浸润水平均更高。

**关键预后基因RPS19BP1的多组学分析**：基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis, GSEA)显示高风险组显著富集E2F靶基因、G2M检查点、mTORC1信号、KRAS信号等增殖相关通路，以及上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)和血管生成等侵袭转移相关通路；低风险组则富集同种异体排斥反应通路。将AUCell评分最相关的前20个基因与预后模型基因取交集，获得RPS19BP1和MALSU1两个核心基因。scRNA-seq分析显示肿瘤样本中RPS19BP1在各细胞类型尤其是上皮细胞中表达水平高于MALSAU1。TCGA-LUAD队列中高RPS19BP1表达患者OS显著更差（p = 0.038）。空间转录组学分析显示，在腺癌原位(adenocarcinoma in situ, AIS)和微浸润性腺癌(minimally invasive adenocarcinoma, MIA)阶段，RPS19BP1表达的空间分布与核糖体生物发生AUCell评分存在一定共定位，位点水平Spearman相关分析显示两者在AIS（r = 0.118, p < 0.05）和MIA（r = 0.134, p < 0.05）中均呈显著正相关。上皮细胞拟时序轨迹分析显示肿瘤组上皮细胞主要分化为状态3，而对照组多处于状态2，RPS19BP1在肿瘤组各拟时相点表达均高于对照组，且在从状态1向状态3转变过程中上调，暗示其与肿瘤进展的潜在关联。CellChat分析预测RPS19BP1⁺上皮细胞与其他细胞群体具有更高的推断相互作用强度，在MIF、VEGF、MDK和LGALS9等 outgoing 信号通路中通讯概率升高。GSEA显示RPS19BP1⁺上皮细胞显著富集核糖体、rRNA加工和RNA翻译等通路。

**RPS19BP1促癌作用的体外验证**：Western blot检测显示RPS19BP1在LUAD细胞系（A549、H1299）中的蛋白表达水平高于正常支气管上皮细胞系BEAS-2B。siRNA敲低RPS19BP1后，克隆形成实验显示A549和H1299细胞克隆形成能力显著降低；EdU融入实验显示增殖细胞比例显著减少；划痕愈合实验显示伤口闭合受到抑制；Transwell实验显示迁移和侵袭能力显著减弱。

## 四、讨论与结论

研究人员在讨论中首先指出，尽管已有大量研究整合scRNA-seq和群体RNA-seq数据构建LUAD预后标志物，但多数研究仅将scRNA-seq用于基础基因表达分析，而本研究的实质性区别在于应用AUCell算法首先在单细胞水平确立核糖体生物发生增强的肿瘤细胞，再基于scRNA-seq分析识别RBRGs，确保与核糖体生物发生具有更直接和稳健的联系。该模型在两个独立外部验证队列的多数生存时间点AUC值大于0.7，预测性能优于现有文献中多数仅经单队列验证或无湿实验验证的模型。

研究人员对14个核心基因进行了详细功能注解：GPRC5A具有情境依赖性双重功能，在p53野生型背景下抑制增殖而p53突变时获得促增殖功能；LGALS3通过驱动免疫抑制性巨噬细胞生成促进肿瘤进展；TM4SF1激活AKT通路促进肺癌细胞增殖和化疗耐药；TIMP1促进细胞周期进展；XRCC5（Ku80）参与DNA损伤修复与放化疗耐药相关；MALSU1调节线粒体核糖体生物发生和翻译活性；CD9与NSCLC脑转移相关；CD68为经典巨噬细胞标志物；WFDC2曾被提出作为肺癌预后生物标志物；HLA-DRB5突变与EGFR-TKI耐药相关；VAMP8通过调控自噬溶酶体成熟参与NSCLC进展。然而，这些基因与核糖体生物发生的功能联系尚待进一步研究。

关于RPS19BP1，研究人员指出该基因又名AORS，2007年由Kim等首次报道，发现其通过直接结合SIRT1增强SIRT1介导的p53去乙酰化从而抑制结肠腺癌细胞凋亡；2013年Knight等证实其为40S核糖体亚基生物发生的必需因子。本研究首次通过多组学分析和体外实验验证其在LUAD中的致癌作用：scRNA-seq显示LUAD上皮细胞RPS19BP1表达高于正常组织；空间转录组学证实其与核糖体生物发生活性的空间共定位，尤其在LUAD早期进展阶段；CellChat预测RPS19BP1⁺细胞在塑造免疫抑制性TME中的潜在作用；值得注意的是，在p53缺失的H1299细胞中敲低RPS19BP1仍可抑制增殖、迁移和侵袭，提示其可能通过至少部分独立于p53的机制维持LUAD细胞恶性表型。但本研究未直接证明RPS19BP1沉默是否改变rRNA合成、核糖体蛋白组成或全局蛋白翻译率，其与核糖体生物发生的机制性联系需进一步研究。

研究人员也坦承研究存在局限：本研究为基于公共数据库的回顾性研究，外部验证队列样本量较小（GSE68571, n=86；GSE8894, n=63），且验证数据集为微阵列平台而训练队列为RNA-seq，跨平台差异可能影响预测准确性；免疫治疗反应预测分析受限于小样本队列（GSE135222, n=27）统计效能不足；模型在临床实际中的稳健性和效用尚待多中心前瞻性试验和更大队列验证；RPS19BP1的功能验证基于瞬时siRNA转染，稳定敲低、挽救实验及异种移植或转移模型将为靶点特异性提供更确切证据。

**研究结论**：在该研究中，研究人员利用scRNA-seq数据构建了基于核糖体生物发生的LUAD预后模型。该模型能有效进行患者风险分层，显示出稳健的预测性能，并与不同的免疫浸润模式相关，提示其在指导免疫治疗决策中的潜在应用价值。这些发现有助于识别预后不良患者，提供以核糖体生物发生生物学过程为核心的潜在治疗靶点，并拓展了对核糖体生物发生在LUAD中作用的理解。