《Journal of Intelligence》：Arming Inactivated Enveloped Virus Vaccines with the GGTA1 Gene: A Potent Method for Amplification of Viral Vaccines Effectiveness and Protection Against Variants
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本综述描述了一种通过靶向抗原呈递细胞（APCs）的广泛摄取来提高灭活包膜全病毒疫苗效力的新方法。一些具有密集聚糖屏障的灭活全病毒疫苗效果欠佳，因为病毒上的多个碳水化合物链（聚糖）掩盖了免疫原性肽，并使病毒周围带有负静电荷，从而减少了APCs的摄取。研究人员假设
本综述描述了一种通过靶向抗原呈递细胞（APCs）的广泛摄取来提高灭活包膜全病毒疫苗效力的新方法。一些具有密集聚糖屏障的灭活全病毒疫苗效果欠佳，因为病毒上的多个碳水化合物链（聚糖）掩盖了免疫原性肽，并使病毒周围带有负静电荷，从而减少了APCs的摄取。研究人员假设，通过工程化这些疫苗病毒在其聚糖屏障上呈现碳水化合物抗原“α-gal表位（α-gal epitope）”，它们将与抗Gal抗体（anti-Gal antibody）形成免疫复合物；从而将其靶向APCs的强力摄取。抗Gal是人类中一种丰富的天然抗体，约占人类循环免疫球蛋白的1%。抗Gal的配体是α-gal表位，该表位由非灵长类哺乳动物和新世界猴通过糖基化酶α1,3半乳糖基转移酶（α1,3galactosyltransferase, α1,3GT）天然合成。该酶由GGTA1基因（GGTA1-gene）编码。在其聚糖屏障上呈现多个α-gal表位的病毒疫苗结合抗Gal并激活补体系统，产生补体趋化裂解肽C5a和C3a，诱导APCs大量募集至疫苗注射部位。病毒颗粒结合的抗Gal进一步通过其Fc“尾”与APCs上的Fcγ受体（Fcγ-receptors, FcγR）结合，将病毒疫苗靶向APCs的强力摄取。该方法的效力在产生抗Gal的小鼠中进行了研究，使用了呈现α-gal的灭活流感病毒疫苗和呈现该表位的HIV的gp120。这些研究表明，与缺乏α-gal表位的相同疫苗相比，经工程化呈现α-gal表位的病毒疫苗将抗病毒抗体产生和病毒特异性T细胞激活提高了15至100倍。研究人员认为，呈现α-gal的灭活SARS-CoV-2病毒疫苗可以诱导针对S蛋白（S-protein）、M蛋白（M-protein）、E蛋白（E-protein）和N蛋白（N-protein）的类似保护性长期免疫记忆。此外，突变S蛋白的免疫逃逸变体可能被针对M蛋白和E蛋白的抗体破坏，感染这些变体的细胞可能被针对N蛋白肽的特异性细胞毒性T细胞（cytotoxic T cells, CTL）杀死。这种抗M蛋白、E蛋白和N蛋白的免疫保护可以防止这些变体的扩增，从而可能避免每6个月或出现新变体时接种COVID-19疫苗的需要。类似的有效免疫化可以通过在聚糖屏障上呈现α-gal表位的灭活埃博拉病毒（Ebolavirus）疫苗实现。对多种埃博拉病毒蛋白产生的免疫反应也可能有助于针对含有进化保守结构蛋白的其他埃博拉病毒物种产生交叉反应保护。制备呈现α-gal表位的全病毒疫苗的一种有效方法是将其与插入病毒基因组的GGTA1基因武装。这样的病毒颗粒将在其聚糖屏障上呈现多个α-gal表位，这将放大其免疫原性，而不是像野生型病毒那样降低免疫原性。
1. 引言
本文介绍了通过将灭活包膜全病毒疫苗靶向抗原呈递细胞（APCs）的广泛摄取来提高其效力的新方法。部分灭活全病毒疫苗（如SARS-CoV-2灭活疫苗）在III期临床试验中保护效力仅为50-90%，需要提高免疫原性。病毒包膜上的聚糖屏障（glycan shield）是降低免疫原性的主要原因之一。本文描述了通过工程化聚糖屏障呈现α-gal表位（α-gal epitope）的新型病毒疫苗（称为α-gal病毒疫苗），并在流感病毒和HIV疫苗中证实其免疫原性提高15-100倍。作者提出，用编码α1,3半乳糖基转移酶（α1,3GT）的GGTA1基因武装包膜病毒，可将聚糖屏障从掩蔽成分转变为大幅提高免疫原性的组分，从而诱导针对保守病毒抗原的长期免疫记忆，保护未来变异株。
2. 聚糖屏障保护包膜病毒
许多包膜病毒在包膜蛋白上修饰有多个聚糖（glycans），这些聚糖由宿主细胞高尔基体中的糖基转移酶合成。常见的是复合型N-连接聚糖，末端带负电荷的唾液酸（sialic acid, SA）。流感病毒血凝素上有5-7个N-连接聚糖，SARS-CoV-2的S蛋白上有22个，HIV的gp120上有24个，埃博拉病毒包膜糖蛋白上有17个。密集的聚糖屏障通过空间位阻掩盖病毒蛋白抗原，且聚糖自身非免疫原性（与宿主细胞相同），导致病毒免疫原性低下，逃逸中和抗体。此外，聚糖屏障还降低了灭活全病毒疫苗的效力：疫苗病毒颗粒需被APCs内化，但聚糖屏障通过两种机制影响摄取效率。
2.1 掩盖病毒抗原
聚糖屏障覆盖包膜糖蛋白表面，掩盖免疫原性肽段，无调理标记时，APCs仅通过随机胞饮（pinocytosis）摄取少量病毒颗粒。
2.2 唾液酸的静电排斥
许多N-连接聚糖末端为带负电荷的唾液酸（SA）。SA的负电荷在病毒和APC膜之间产生ζ电位（zeta potential），导致彼此排斥，减少病毒颗粒靠近APC膜的机会，从而降低内化数量。本文提出通过呈现α-gal表位（α-gal epitope）将聚糖屏障转化为疫苗的增强组分，该表位结合天然抗Gal抗体（anti-Gal antibody），诱导APCs大量募集和强力靶向摄取。
3. 天然抗Gal抗体与α-gal表位
抗Gal是人类最丰富的天然抗体之一，约占循环免疫球蛋白的1%，由肠道菌群抗原持续刺激产生。其配体为三糖Galα1-3Galβ1-4GlcNAc，即α-gal表位。该表位由α1,3半乳糖基转移酶（α1,3GT）合成，酶由GGTA1基因编码。非灵长类哺乳动物、狐猴和新世界猴存在该基因，而旧世界猴、猿和人类因GGTA1基因失活（约2000-3000万年前的碱基缺失）而不表达α-gal表位，但产生抗Gal抗体。病毒在含活性α1,3GT的宿主细胞中增殖时会呈现α-gal表位，可结合人类血清中的抗Gal并被补体中和。
4. 关于抗Gal介导的灭活病毒疫苗效力放大的假说
假说认为，将GGTA1基因插入疫苗病毒基因组，可使其包膜聚糖呈现α-gal表位。这些表位结合抗Gal后激活补体系统，产生C5a和C3a趋化肽，大量募集APCs（树突状细胞和巨噬细胞）至疫苗注射部位。同时，抗Gal的Fc段与APCs上的Fcγ受体（FcγR）结合，导致疫苗病毒颗粒被APCs强力吞噬（调理作用）。APCs将大量病毒抗原转运至区域淋巴结，加工并呈递抗原肽，激活病毒特异性CD4
+和CD8
+ T细胞，诱导强效体液和细胞免疫应答及长期免疫记忆。该假说通过α-gal纳米颗粒（模拟灭活α-gal病毒）在产生抗Gal的GT-KO小鼠中得到验证：注射α-gal纳米颗粒后，巨噬细胞大量募集并吞噬抗Gal调理的颗粒。
5. 抗Gal介导的免疫抗原向淋巴结的转运增加
使用包裹卵清蛋白（OVA）的α-gal脂质体模拟α-gal病毒疫苗，在抗Gal产生的GT-KO小鼠中，OVA被APCs加工并呈递SIINFEKL肽。与缺乏抗Gal的小鼠相比，呈递SIINFEKL的APCs数量增加7-8倍，疫苗特异性T细胞增加15倍，抗OVA抗体产生增加30-100倍。表明抗Gal是放大α-gal疫苗效力的关键组分。
6. α-gal流感病毒疫苗免疫原性的放大
用灭活流感病毒株PR8（H1N1）制备疫苗，通过重组α1,3GT（rα1,3GT）和UDP-Gal将其聚糖改造为呈现α-gal表位（PR8α-gal）。抗Gal产生的GT-KO小鼠两次免疫PR8α-gal（1 μg，含Ribi佐剂）后，抗PR8抗体效价较PR8组高约100倍；野生型小鼠中无差异。攻毒实验显示，PR8α-gal免疫组肺内病毒滴度较PR8组低10-100倍，生存率达89%（PR8组仅11%）。表明α-gal病毒疫苗诱导了更强的保护性免疫应答，且依赖抗Gal的免疫复合物形成。
7. HIV α-gal gp120疫苗免疫原性的放大
将HIV包膜糖蛋白gp120（含24个N-连接聚糖，半数末端为SA）通过神经氨酸酶和rα1,3GT替换为α-gal表位，得到gp120α-gal。抗Gal产生的GT-KO小鼠两次免疫（5 μg，含Ribi佐剂）后，ELISPOT显示gp120特异性IFN-γ分泌T细胞数量为gp120组的约14倍（332 vs 23/10
6 脾细胞），抗gp120抗体效价高约100倍，且血清中和HIV的滴度达200-600（gp120组≤10）。表明α-gal修饰可同时增强可溶性病毒蛋白的体液和细胞免疫应答。
8. α-gal表位作为疫苗免疫原性的通用增强剂
α-gal疫苗免疫原性增强原理适用于多种疫苗类型。牛血清白蛋白（BSA）经α-gal修饰后在抗Gal小鼠中免疫原性显著提高。肿瘤细胞经工程化呈现α-gal表位后，可转化为有效抗肿瘤疫苗，诱导保护性免疫。此外，α-gal表位存在于疟原虫、锥虫和利什曼原虫等原生动物表面，含α-gal的疫苗可提高抗Gal滴度，提供预防这些原虫感染的保护。
9. 灭活COVID-19 α-gal全病毒疫苗预防未来变异株
针对SARS-CoV-2，mRNA疫苗（S蛋白）保护效力随时间下降，需每6个月加强接种，可能与S蛋白的密集聚糖屏障和唾液酸负电荷导致APCs摄取不足有关。S蛋白突变株（如Omicron BA.1）可逃逸抗S蛋白抗体。因此需要多抗原疫苗。灭活全病毒疫苗虽含所有SARS-CoV-2抗原（S、M、E、N蛋白），但III期临床试验效力不理想（50-85%）。基于α-gal流感疫苗和gp120疫苗的研究，假设灭活SARS-CoV-2全病毒疫苗经α-gal修饰（SARS-CoV-2α-gal）后，可诱导针对S、M、E、N蛋白的强效免疫和长期记忆，尤其是保守的M、E、N蛋白，从而中和S蛋白突变株。该疫苗的公共健康效益包括：长期有效免疫记忆（无需每6个月加强）、针对未来变异株（由抗M/E/N免疫清除）、避免针对新变异株反复开发疫苗。
10. 建议用GGTA1基因武装灭活全病毒疫苗：以SARS-CoV-2α-gal为例
最直接的工程化方法是向病毒基因组插入非灵长类哺乳动物的GGTA1基因开放阅读框。病毒在感染细胞后转录翻译α1,3GT，在高尔基体反式区合成多个α-gal表位于病毒聚糖上。尽管在含活性α1,3GT的非灵长类细胞中培养病毒也可获得α-gal表位，但由于糖基转移酶竞争，表位数量可能不足。而病毒自身携带GGTA1基因可产生高浓度α1,3GT，确保表位数量充足。已有三种病毒成功武装GGTA1基因：腺病毒（Adα-gal，用于肿瘤疫苗）、新城疫病毒（NDVα-gal，用于溶瘤治疗）、流感病毒（NAα-gal，减毒活疫苗）。这些研究证实了病毒携带的α1,3GT可在感染细胞膜上合成α-gal表位，并通过抗Gal介导的吞噬增强免疫。因此，灭活病毒疫苗采用GGTA1基因武装可行。
11. 建议用GGTA1基因武装灭活全病毒疫苗：以埃博拉病毒为例
埃博拉病毒属于丝状病毒科，包膜糖蛋白（GP）有17个N-连接聚糖和粘蛋白样区域，形成密集聚糖屏障。目前尚无完全有效的疫苗。建议EBOVα-gal疫苗（GP聚糖呈现α-gal表位）的优点：1）抗GP抗体可中和感染病毒；2）病毒内部蛋白（NP、L、VP40、VP35、VP30、VP24）可作为CTL靶点，多抗原疫苗可形成记忆CTL杀死感染细胞，并能清除GP免疫逃逸变异株；3）不同埃博拉病毒物种的内部蛋白保守，EBOVα-gal疫苗可能引起种间交叉保护免疫。目前尚无关于埃博拉病毒呈现α-gal表位的工程化信息，但可通过武装GGTA1基因实现。
12. 局限性
12.1 含GGTA1基因病毒的产量
减毒流感病毒NAα-gal在MDCK细胞中的滴度比野生型低2.5 log。原因可能与基因插入位置、聚糖改变稳定性等有关。可通过调整插入位点、筛选宿主细胞、或采用体外酶促合成α-gal表位、使用多拷贝GGTA1基因细胞系、或用复制缺陷腺病毒转导宿主细胞来补救。
12.2 减毒活病毒疫苗的局限性
减毒病毒呈现α-gal表位后，可结合抗Gal并被补体或抗体依赖性细胞毒作用（ADCC）杀死，导致病毒扩增受限，个体间效力差异大。而灭活α-gal全病毒疫苗无论抗Gal滴度高低均可保证APCs靶向吞噬。
12.3 α-gal综合征的局限性
部分个体因蜱虫叮咬产生抗Gal IgE，对红肉α-gal表位过敏（α-gal综合征）。接种α-gal疫苗前需询问是否有该综合征及肉过敏史，接种时需给予抗过敏药物。
13. 结论
抗Gal抗体存在于所有非严重免疫抑制的人类，提供了提高包膜病毒疫苗效力的新途径。α-gal病毒疫苗（聚糖屏障呈现α-gal表位）注射后与抗Gal形成免疫复合物，激活补体募集APCs，并通过FcγR介导强力吞噬，转运大量抗原至淋巴结，诱导针对多种病毒抗原的强效保护性免疫和长期记忆。因此，SARS-CoV-2α-gal灭活全病毒疫苗可通过抗M、E、N蛋白免疫保护针对S蛋白突变株。类似方法可应用于埃博拉病毒疫苗。通过GGTA1基因武装，将聚糖屏障从降低免疫原性转变为增强免疫原性，是放大疫苗效力的关键方法。
