综述：脑空间基因组学图谱

《Genes》：Brain Spatial Genomics Atlases

　　

单细胞RNA测序（scRNA-seq^→）的近期进展通过识别参与脑发育和功能的基因、细胞类型及分子通路，变革了神经科学研究。然而，scRNA-seq^→缺乏关于基因表达解剖位置的空间信息。新兴的空间基因组学技术，包括MERFISH、CosMx、Stereo-seq和Visium Spatial Gene Expression，通过在完整组织架构内进行转录组学和表观基因组学分析，克服了这一限制。空间基因组学与scRNA-seq^→的整合，通过允许在细胞甚至亚细胞分辨率下原位映射基因表达，革命化了基因组学和生物医学研究。这些进展促进了多个物种（包括小鼠、人类、非人灵长类动物和斑马鱼）脑空间基因组学图谱的构建。空间基因组学技术在与单细胞测序方法整合时，对于定义跨脑区的细胞异质性和表征神经回路的空间组织尤为有价值。这些参考图谱为研究脑发育、功能和疾病，以及识别与神经疾病相关的区域特异性分子特征提供了强大资源。在此，研究人员综述了当前可用的脑空间基因组学图谱以及用于生成这些参考资源的空间基因组学技术。

1. 引言
空间基因组学（spatial genomics）聚焦于在组织或细胞的空间位置背景下研究基因表达和基因组组织。空间转录组学（spatial transcriptomics, ST）能够在保留基因在组织内空间定位的同时，同时测量数千个基因，部分情况下达到单细胞分辨率。脑空间基因组学图谱（如Allen小鼠脑图谱）原位（即在其解剖学背景下）映射跨脑区的基因表达，通常以单细胞或近单细胞分辨率创建参考图谱。这些图谱通常结合空间转录组学、单细胞RNA测序（scRNA-seq^→）和先进成像技术，以全面揭示基因在脑内时空表达的模式。本文综述了跨多个物种（包括小鼠、人类、斑马鱼和非人灵长类动物）的空间转录组学和表观基因组学脑图谱的最新进展，并回顾了当前和新兴的空间组学技术应用，例如研究在疾病中失调的特定基因或通路，以及加速识别神经疾病的新疗法。此外，讨论了脑空间基因组学图谱的前景和潜在影响。

2. 脑空间基因组学图谱中使用的主要空间基因组学技术
近年来空间基因组学技术发展迅速，本文仅提供主要空间基因组学平台（特别是用于构建脑空间基因组学图谱的平台）的高层概述。表1总结了这些技术的关键特征，包括开发者、商业平台、基于测序或成像的方法、发布年份、检测机制、主要应用、优势和局限性，并提供了描述每项技术的原始出版物或对应公司网页的参考文献。

3. 小鼠脑空间转录组学图谱
2006年，Allen脑科学研究所发布了Allen小鼠脑基因表达图谱，这是首个涵盖所有小鼠脑区所有蛋白编码基因的详细空间图谱。通过大量原位杂交（in situ hybridization, ISH）实验，研究人员绘制了小鼠脑内超过20,000个基因，提供了最全面的基因表达图。尽管实验流程大部分自动化，但由于每个基因需要独立的ISH实验，该图谱耗时数年完成。该开源图谱在识别新细胞类型和推进神经疾病研究方面产生了深远影响。
随后，为加速ISH实验的漫长流程，更高通量的方法应运而生。2015年，MERFISH（multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization）问世，这是一种基于成像的空间转录组学方法，通过预定义的基因面板可同时原位成像数百个基因。该方法使用分配给目标RNA物种的独特条形码，经过多轮荧光成像以显示组织中特定位置的条形码，并采用了纠错方法提高了成像型ST的准确度。
在一项里程碑式研究中，Zhang等人使用MERFISH结合scRNA-seq^→和单核RNA测序（snRNA-seq^→），生成了小鼠初级运动皮层的空间解析细胞图谱，鉴定出95个不同细胞簇（包括神经元和非神经元细胞）。通过与逆行示踪工具霍乱毒素B亚单位结合，确定了端脑内神经元的特定投射模式，实现了高分辨率基因表达捕获和空间定位。该图谱为研究帕金森病等运动障碍提供了健康与运动缺陷小鼠的空间基因表达比较基础。
此外，Yao等人使用MERFISH整合scRNA-seq^→，构建了全小鼠脑的高分辨率空间转录组学图谱，包含约430万个细胞（空间数据集）和约400万个脑细胞的scRNA-seq^→转录组数据集。他们发现非神经元亚类在脑区间分布更广泛，而神经元亚类则局限于特定区域，并分析了神经元和非神经元细胞类型，发现每种细胞类型的转录组身份与空间特异性高度对应。该全脑图谱建立了基准参考资源，支持细胞和回路功能、发育及哺乳动物脑进化的综合研究。
成像型ST方法随后涌现了STARmap PLUS，Shi等人构建了小鼠中枢神经系统的分子分辨率空间图谱，靶向106个脑区并检测1022个基因面板。STARmap PLUS使用特异性探针将RNA分子转化为带有基因特异性条形码的DNA扩增子，通过在组织水凝胶中多轮原位测序进行可视化。虽然基因检测通量不如MERFISH，但通过直接在完整组织内结合成像与原位测序，提供了显著更高的分辨率。该方法与腺相关病毒结合，实现了中枢神经系统的空间映射和关键细胞类型鉴定。分子标志物鉴定的组织区域与解剖区域高度相关，其中丘脑、纹状体、嗅球和大脑皮层的分子标志物与Allen原位杂交数据库一致。
基于测序的ST方法（如10x Genomics的Visium）克服了成像型方法需预先设定基因面板的检测偏差。Visium于2019年发布，通过将脑切片置于带有捕获区域的特制玻片上（每个捕获区域含近5000个条形码），实现全转录组覆盖，可检测组织切片中所有mRNA，基因数量比MERFISH、CosMX和STARmap Plus多10-12倍，但分辨率较低。Salem等人使用10x Visium分析酒精依赖小鼠模型前额叶皮层，识别出与酒精依赖相关的大量基因，并确定近二十个脑区的Visium空间基因表达与Allen脑图谱高度一致。Di Marco等人构建了胚胎小鼠脑（胚胎第13.5天）的空间转录组图谱，研究神经发生关键阶段的空间基因表达景观，识别出GABA能和谷氨酸能神经元的起源，整合scRNA-seq^→数据集后解析了胚胎发育阶段差异表达基因的分布。

4. 小鼠脑空间表观基因组图谱
空间转录组脑图谱的出现促使科学家认识到需要更全面的脑表观基因组图谱。表观基因组是DNA及其相关蛋白上调控基因表达的化学标记全集，是构建小鼠脑细胞类型图谱的关键方面。这些化学修饰通过影响基因组区域与RNA聚合酶和转录因子的接近度来调节基因表达。表观基因组通常通过亚硫酸氢盐测序（检查甲基化胞嘧啶）或ATAC（transposase-accessible chromatin with sequencing）进行分析。单细胞表观基因组学为研究脑细胞类型间的染色质可及性和差异甲基化奠定了基础。新兴的空间表观基因组学旨在空间背景下分析DNA甲基化、染色质构象和可及性等表观基因组变化。尽管在分辨率、组织处理敏感性和稀疏信号方面存在局限，科学家正致力于构建高质量的空间表观基因组图谱以补充转录组图谱。
DNA甲基化是表观基因组调控的标志，指在CpG二核苷酸中胞嘧啶环5-碳位置添加甲基基团，可通过阻断转录因子结合或促进染色质凝聚抑制基因表达。特定基因的低甲基化或高甲基化可导致严重病理后果，例如阿尔茨海默病中PIN1（peptidoprolyl cis/trans isomerase, NIMA-interacting 1 gene）基因的高甲基化是区分阿尔茨海默病与额颞叶痴呆的重要生物标志物。为评估脑内空间甲基化多样性，Liu等人利用单核甲基化组测序（snmC-seq2^→）、单核ATAC测序（snATAC-seq^→）和单核甲基化与染色体构象捕获测序（sn-m3C-seq^→），以单细胞碱基分辨率构建了小鼠脑DNA甲基化图谱。这些技术定义了成年第56天（P56）小鼠脑的甲基化组、染色质构象和全基因组可及染色质，整合人工神经网络（ANN^→）后识别出皮层兴奋性神经元中具有差异甲基化的转录因子基因。ANN^→预测模型揭示了神经元甲基化组中的极端空间多样性，正确预测了大多数细胞亚型的空间信息及精确皮层分层，但无法区分5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶两种具有不同调控作用的表观遗传修饰。
作为上述P56脑空间甲基化图谱的伴随研究，Liu等人利用snmC-seq3^→和snm3C-seq^→技术，从超过100个脑区获取数十万甲基化及染色质构象-甲基化联合图谱，结合MERFISH空间转录组数据，证明表观遗传调控与空间转录组数据强相关。例如，Rasgrf2（Ras protein specific guanine nucleotide releasing factor 2）基因在不同皮层层次中差异表达且差异甲基化。由于胞嘧啶DNA甲基化是小鼠行为研究的重要指标，理解动态小鼠脑的空间表观基因组可能为脑疾病（如注意缺陷/多动症或焦虑症）提供新见解。
空间甲基化组学方法的一个显著局限性是空间组织通常通过计算推断而非直接测量。Liu等人的研究使用单细胞甲基化组图谱结合计算分析来解码空间模式：第一项研究使用ANN^→预测空间组织，第二项研究整合空间转录组数据集估计空间位置，因此结果依赖于计算预测模型和跨模态整合的准确性。此外，单细胞甲基化组数据本质稀疏，仅捕获每个细胞中部分甲基化胞嘧啶，增加了对计算方法的依赖。目前仍需更直接的空间甲基化分析方法来原位解析甲基化状态并构建更多参考图谱。现有工作表明空间表观基因组图谱在提供基因调控机制的重要背景及补充转录组数据方面具有重要影响。

5. 发育中小鼠脑的空间染色质可及性与组蛋白空间多组学分析
表观基因组学的另一组成部分是染色质可及性，描述RNA聚合酶和转录因子等大分子与染色质内DNA结合的能力，由染色质结合因子和核小体的组织决定。当染色质处于封闭状态时，转录因子无法结合DNA启动转录，可能导致基因表达改变，与异常生理和疾病状态相关。染色质可及性通常通过ATAC-seq（assay for transposase-accessible chromatin using sequencing）或其单细胞/核版本（scATAC-seq^→/snATAC-seq^→）测量，但缺乏空间背景。空间ATAC-seq（spatial ATAC-seq）是一种新开发的方法，通过原位Tn5转座化学与微流体确定性条形码系统结合，提供高分辨率空间染色质可及性信息。Deng等人利用该方法对小鼠和人类胚胎脑组织进行了研究，整合scATAC-seq^→鉴定细胞类型后，显示小鼠脑E11和E13两个发育阶段存在显著差异。结合scRNA-seq^→，空间背景下的染色质可及性分析将推进对脑内特定结构-功能关系的研究。
此外，Zhang等人开发了空间CUT&TAG-RNA-seq（spatial CUT&TAG-RNA-seq），用于对胚胎和幼年小鼠脑以及成年人类脑的组织切片进行组蛋白修饰和全转录组的分层空间多组学共分析。单细胞CUT&TAG已用于测定H3K4me3等组蛋白修饰。空间CUT&TAG-RNA-seq采用与空间ATAC-seq相同的Tn5转座过程，并添加了针对目标组蛋白修饰的抗体。研究人员评估了P21和P22小鼠脑组织切片中三种不同组蛋白修饰（H3K27me3、H3K27ac、H3K4me3）的空间位置，发现数十个不同簇，反映了空间解析的染色质状态，可能对应细胞类型特异性调控机制及基因激活或抑制的区域差异。空间CUT&TAG-RNA-seq与单细胞CUT&TAG数据的整合显示两者高度一致，验证了空间模态在全基因组组蛋白修饰分析中的有效性。
这些技术仍存在局限性，包括缺乏标准化方案、基准数据集和跨平台验证。当前方案对组织保存条件敏感，新鲜冷冻组织效果最佳，而福尔马林固定石蜡包埋组织的空间ATAC-seq方案仍在优化。空间CUT&TAG-seq和空间CUT&TAG-RNA-seq目前仅兼容新鲜冷冻组织，且无法一致达到真正单细胞分辨率，每个空间像素可能包含来自多个细胞的染色质可及性模式，导致细胞类型特异性调控元件难以分配，稀有细胞群体可能被邻近丰富细胞类型掩盖。为克服此限制，空间染色质可及性数据集可与scATAC-seq^→和scRNA-seq^→参考图谱整合，但准确度依赖于参考数据集质量及计算整合与解卷积过程的性能。尽管如此，这些工具为神经科学研究提供了宝贵见解，可用于识别关键疾病生物标志物和调控机制，并促进健康与疾病脑组织的全面空间表观基因组图谱开发。

6. 不同发育阶段的人类脑空间转录组学图谱
与小鼠相比，人类脑表达的信使RNA（mRNA）转录本数量更大且更复杂。跨物种比较显示，大多数差异表达基因在人类中上调，这种现象在其他组织中不明显。人类脑在发育过程中表达约85%的基因组编码基因，高于其他任何组织类型。然而，获取人类脑组织样本困难，通常为可能发生RNA降解的死后或存档样本。表2总结了当前发表的人类空间脑图谱及其关键应用和广泛影响。
人类脑表现出比小鼠更高的细胞类型多样性和区域特异性，图谱构建需要更多脑切片和生物重复，计算密集且昂贵。许多单细胞研究探索了人类脑发育特定区域（主要是出生后到成熟期的新皮层），但常缺乏孕早期信息。Braun等人通过scRNA-seq^→和空间转录组学从26个人类脑标本（孕5-14周）构建了孕早期发育中人类脑的综合细胞图谱，鉴定出616个细胞簇并注释了类别、亚类、空间位置、胚胎年龄分布和特定基因表达标志物。他们发现脑内主要细胞类型（如神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞）均由区域特异性放射状胶质细胞发育而来，并通过中间细胞状态过渡。与成年脑相比，胚胎脑的区域特异性胶质细胞呈现相似模式，表明高度区域化的人类脑由区域特异性星形胶质细胞和少突胶质细胞分化而来。Velmeshev等人虽未使用空间基因组学技术，但通过单细胞分析描绘了人类脑皮层特定细胞类型（包括兴奋性神经元、中间神经元和胶质细胞亚型）的发育程序，识别了皮层发育中的关键转录网络及性别特异性变化，对探索发育性脑疾病（如自闭症）至关重要。
Li等人使用单细胞空间增强分辨率组学测序（scStereo-seq^→）构建了人类胚胎脑的时空发育图谱，涵盖孕6周至23周的多个时间点和不同脑区（新皮层、下丘脑、间脑、中脑和小脑）。他们将神经祖细胞（NPCs^→）分为五个亚类：放射状胶质细胞（RG^→）、皮层特异性中间前体细胞（IPC^→）、小脑特异性颗粒细胞前体（GCP^→）、前体1（Prec1）和前体2（Prec2）。scStereo-seq^→在传统Stereo-seq空间条形码基础上结合单细胞提取方法实现单细胞分辨率。RG^→最早出现并显示显著区域异质性，转录因子TFAP2C在人类大脑皮层RG^→中特异性表达。空间可视化不仅展示了RG^→亚型的空间分布，还为后续神经元区域特化提供了关键线索。结合scRNA-seq^→与scStereo-seq^→，计算并重建了各区域特定神经元亚群的时空发育轨迹，展示了人类脑神经元亚型的时空动态和区域多样性。
空间转录组学还可用于研究同一脑区不同层次间的连接和横截面关系。Maynard等人结合snRNA-seq^→与高通的10x Visium空间转录组学技术，定义了六层人类背外侧前额叶皮层（DLPFC）的基因表达空间地形图，揭示了不同皮层层次的神经元具有不同的基因表达模式以及形态、生理和连接模式。他们识别出FABP7（fatty acid binding protein 7 gene）、ADCYAP1（adenylyl cyclase activating protein 1 gene）和PVALB（parvalbumin gene）等在DLPFC中表达但未被Allen脑研究所资源归类为层标志物的基因。通过神经精神疾病基因集的整合分析，发现人类脑中层次富集基因与精神分裂症和自闭症谱系障碍相关。
Huuki-Myers等人利用snRNA-seq^→和Visium平台构建了高分辨率、数据驱动的人类DLPFC空间图谱，使用来自10名捐赠者的30个DLPFC组织块，识别出不同空间域和细胞间通讯模式，为理解脑结构和功能提供了分子机制背景，以及与神经发育障碍和精神疾病相关的细胞类型特异性基因表达变化的解剖学背景。
现有研究多集中于正常或发育中脑组织的空间转录组学，较少探索病理状态的变化。Zheng等人利用创伤性脑损伤患者的脑组织，整合空间转录组学和代谢组学构建了图谱，发现空间转录组学可揭示损伤脑的不同分子区域化，帮助区分中度和重度脑损伤的细胞簇变化（小胶质细胞、NK细胞、T细胞和少突胶质细胞分布不同），且神经元丢失在空间上与脂质过氧化、代谢变化和局部基因表达一致。Sankowski等人通过多组学（包括scRNA-seq^→和空间转录组学）构建了人类中枢神经系统中先天免疫细胞在胎儿发育、成年和病理过程中的空间多组学景观。
丘脑是感觉的高级中枢和最重要的感觉传导中继站，除嗅觉外的各种感觉传导通路均在丘脑中继。Kim等人构建了发育中人类丘脑的时空分子动力学图谱，发现孕早期丘脑发生神经发生生成谷氨酸能和GABA能神经元；孕中期谷氨酸能神经元分化为两个亚型，GABA能神经元数量显著增加并广泛分布。此外，观察到胶质细胞的空间分辨率模式及其随时间的出现和成熟，如两种星形胶质细胞亚型分别富集于丘脑和邻近脑区。这些发现有助于理解人类脑的进化过程，特别是在细胞水平上深化对丘脑发育和脑复杂性的认识。总体而言，人类脑空间转录组学图谱的构建仍在发展中，但该领域进展迅速，引起了科学界的浓厚兴趣。

7. 非人灵长类动物脑空间转录组学图谱
猕猴在高级认知和社会行为方面是与人类最接近的模式动物，具有更大的皮层和更多细胞类型。猕猴脑包含约60亿神经元，根据分子、形态或生理特征分为数百种类型，分布数百个脑区，相互连接形成复杂神经回路。阐明猕猴大脑皮层的细胞组成和空间分布模式对揭示灵长类脑的组织原理至关重要，且因其高遗传相似性常用于验证人类脑空间转录组和单细胞测序图谱。表2描述了当前可用的猕猴空间脑图谱，包括解决的科学问题和对科学界的广泛影响。与人类脑图谱相比，猕猴单细胞RNA-seq图谱缺乏，导致细胞类型注释和空间模式验证不完整，且因伦理约束获取样本困难，死后样本易发生RNA降解。Chen等人使用snRNA-seq^→和Stereo-seq完成了猕猴大脑皮层首个单细胞空间图谱，处理了来自两只动物左半球扣带回的67个固定冷冻冠状切片，发现大量兴奋性神经元、抑制性神经元和非神经元细胞在大脑皮层中呈现特定层次和区域分布，视觉和体感系统的细胞组成与脑区层次组织之间存在显著相关性。跨物种比较显示，某些第IV层兴奋性神经元仅存在于灵长类中，其特异性高表达基因与人类疾病相关。该研究提供了灵长类皮层内细胞类型层次和区域特异性分布及基因表达特征的最全面数据。
Micali等人使用猕猴样本，通过scRNA-seq^→和10x Visium空间转录组学技术，聚焦于整个端脑发育及调控神经细胞空间分布的分子过程。基于超过70万个单细胞的深度测序，区分了神经发生中的多种细胞亚型（神经干细胞、兴奋性和抑制性神经元、胶质细胞和非神经细胞），并识别了端脑中心发育早期的祖细胞，预测了协调该细胞模式功能的基因调控网络。这些资源有助于研究灵长类和人类的端脑发育、脑进化和疾病。
Lei等人利用先进的空间转录组学和染色质可及性技术，构建了成年猕猴皮层的单细胞水平综合图谱，聚焦于前额叶皮层（PFC^→）、初级运动皮层（M1）和初级视觉皮层（V1）三个关键区域。通过整合scATAC-seq^→、scRNA-seq^→与空间增强分辨率组学测序（Stereo-seq），绘制了这些区域的调控图谱和染色质可及性。进一步比较了成年猕猴和人类少突胶质细胞的发育轨迹，确定了两个物种间的异同。将遗传变异和疾病相关基因扰动映射到猕猴皮层特定细胞类型，为理解这些因素对人类神经疾病的影响提供了宝贵见解。

8. 斑马鱼脑空间转录组学图谱
空间转录组学已应用于其他物种如斑马鱼。斑马鱼因其透明胚胎和快速繁殖率成为研究脊椎动物发育的理想模式生物。一项近期研究使用Stereo-seq技术，鉴定了斑马鱼胚胎发生中涉及的关键通路，通过对24小时受精后六时间点的斑马鱼胚胎应用Stereo-seq，填补了基因表达和细胞定位知识的空白，提供了配体-受体对的空间解析数据，并辅助细胞类型确定。24-hpf切片的19个空间模块在空间分布和生物学功能上高度一致。通过整合scRNA-seq^→数据建模胚胎细胞状态转换，映射细胞类型发育轨迹，发现两个神经干细胞（NSCs^→）簇在两个数据集中非常一致，进一步空间亚聚类确定这些NSCs^→将分化为后脑NSCs^→或初级运动神经元等细胞类型。
Holler等人使用空间转录组学和scRNA-seq^→检查斑马鱼发育最初几小时的时空转录组，采用tomo-seq方法以高空间分辨率测量单细胞阶段受精卵的RNA定位，利用dazl等模式基因检查定位模式。对两个近缘物种（非洲爪蟾和热带爪蟾）进行空间转录组分析后，发现dazl（deleted in azoospermia-like gene）在生殖细胞特化中具有保守作用。该研究进一步验证了空间整合与scRNA-seq^→的高价值，以及其在构建细胞类型图谱以研究斑马鱼发育中的应用。

9. 脑空间基因组学图谱的前景
尽管已为小鼠、人类及其他物种构建了脑空间基因组学图谱，但大鼠及许多其他物种的空间脑基因组学参考图谱仍不可用。当前的研究致力于创建更全面、整合的多组学脑图谱，并开发能够以更高空间分辨率映射脑的新技术。随着空间基因组学技术的持续进步，预期将为大鼠等更多物种提供脑空间基因组学图谱。
人工智能（AI）和计算建模的进步也将通过提供对脑组织和功能的新见解来变革该领域。例如，空间基因组学与AI的整合可能实现三维脑图谱的重建、从结构预测功能，以及基于分子和细胞架构的脑疾病计算模型的开发。基于AI的方法在空间基因组学分析中日益重要，包括细胞类型解卷积、聚类、细胞间通讯分析以及与scRNA-seq^→和其他单细胞多组学数据集的整合。深度学习和机器学习方法有望在克服日益大规模和复杂空间基因组学数据集的计算挑战中发挥核心作用。通过持续的技术创新和跨学科合作，脑空间基因组学图谱将成为理解脑功能以及阿尔茨海默病和帕金森病等神经疾病分子基础的强大资源。