《Biosensors and Bioelectronics》：GLASS-seq: a gel-anchored, ligation-assisted, scalable biosensing platform for low-cost regional spatial transcriptomics
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空间转录组学（Spatial transcriptomics）仍然受限于成本、设备负担，以及对小区域感兴趣区（ROI）内预定义低丰度靶标检测效率不足。研究人员提出GLASS-seq（凝胶锚定、连接辅助、可扩展空间测序，Gel-anchored, Ligatio
空间转录组学（Spatial transcriptomics）仍然受限于成本、设备负担，以及对小区域感兴趣区（ROI）内预定义低丰度靶标检测效率不足。研究人员提出GLASS-seq（凝胶锚定、连接辅助、可扩展空间测序，Gel-anchored, Ligation-Assisted, Scalable Spatial sequencing），这是一种水凝胶包埋、探针连接型生物传感平台，可在无需专用仪器的条件下，以约100 μm横向分辨率将原位RNA识别转化为数字化测序读出。靶标特异性的分裂探针（split probes）仅在正确的双重识别发生时，才会被SplintR连接酶（SplintR ligase）连接；连接产物再通过带有丙烯酰胺标记的锚定序列可逆固定于聚丙烯酰胺网络中，从而在染色、成像和显微切割过程中限制扩散。最简聚合酶链式反应（PCR）进一步添加空间X/Y条形码，生成带有ROI索引的文库。
在多种小鼠组织中，GLASS-seq实现了高捕获保真度（>96%正确探针对恢复率）、稳健的正确序列读段保留率（≈81%）、较强重复性（r ≥ 0.98），并且在严格阴性对照（-ligase、-anchor、single-arm、mismatch）下表现出较高信号背景比。在脑切片中，研究人员利用731基因面板，对按500 μm间隔网格采样的212个ROI进行分析，并通过操作者引导的网格切割获得样本，最终得到与宏观神经解剖结构一致的连续空间结构域，并与公共原位杂交图谱（ISH，in situ hybridization）显示出较强一致性（r = 0.85）；同时仅需适中的测序深度（每个ROI约0.42 Gb），代表性每张切片成本约为512美元。该流程兼容免疫荧光（IF，immunofluorescence）和原位杂交（ISH，in situ hybridization），并可推广应用于心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏。总体而言，通过将原位连接和水凝胶锚定构建为阵列化分子生物传感器，并以测序作为数字换能器（digital transducer），GLASS-seq为区域空间RNA定量提供了一种稳健、经济且可扩展的方法，适用于大队列研究及转化应用。
该论文发表于《Biosensors and Bioelectronics》，围绕空间转录组学在实际应用中的关键瓶颈，提出了一种面向区域尺度空间RNA定量的新型平台GLASS-seq。空间基因表达的组织分布决定了组织结构、细胞间通讯以及疾病演进过程，因此空间转录组学已成为解析复杂组织的重要工具。现有技术虽然发展迅速，但在大样本、低成本和高可扩展应用方面仍存在明显不足。基于显微切割或物理取样的方法能够获得区域表达谱，但边界不够精确，样本处理过程中容易造成RNA损失，也难以与分子标志精确对齐；基于成像的方法虽然可实现单细胞乃至亚细胞分辨率，但通常需要复杂的多轮杂交、专用流体系统与显微成像设备，通量与成本压力较大；基于阵列或条码捕获的平台可以提供较广的转录组覆盖，但受限于捕获位点尺寸和分子扩散，容易模糊局部结构，而且往往需要较深测序，且对低拷贝RNA不够敏感。正因如此，当前尚缺乏一种依赖常规设备和常见试剂、兼顾精确定义区域、保持分析物原位定位并对低丰度转录本具备较高灵敏度的低成本空间转录组流程。
为解决上述问题，研究人员从生物传感的视角重新定义空间RNA检测过程，将其视为原位分子识别与稳定信号转导的耦合系统，并开发了GLASS-seq（Gel-anchored, Ligation-Assisted, Scalable Spatial sequencing）。该方法的核心思想是：靶标RNA首先被一对左右分裂探针识别，只有当两条探针同时正确结合到同一转录本相邻位置时，SplintR连接酶才会介导连接，形成可扩增DNA模板；随后，带有丙烯酰胺修饰的锚定寡核苷酸与连接产物杂交，并共聚到聚丙烯酰胺凝胶网络中，从而将探针复合物稳定固定在组织原位，避免其在染色、成像、脱水收缩和人工显微切割过程中扩散；最后，通过最简PCR引入空间X/Y条形码和测序接头，获得带有ROI索引的测序文库。研究表明，该平台在约100 μm横向分辨率水平上即可实现区域化空间采样，且无需专门仪器。论文最终得出的结论是，GLASS-seq能够以较低成本、较低设备门槛和较高重复性实现区域空间RNA定量，尤其适用于大队列、多区域、转化导向的研究场景。其重要意义在于，它在空间转录组技术谱系中提供了一个不同于高端成像平台和全转录组无偏捕获平台的实用操作点，强调目标基因面板、区域尺度采样以及可扩展部署。
研究人员用于开展该研究的关键技术方法主要包括以下几类：首先，在样本层面，采用8周龄雄性C57BL/6J小鼠的新鲜脑、心、肝、脾、肺、肾组织，制备10 μm冷冻切片；其次，在分子检测层面，利用分裂探针双臂识别、SplintR连接酶介导原位连接、丙烯酰胺标记锚定探针与聚丙烯酰胺凝胶共聚固定，实现RNA信号原位保留；再次，在空间解析层面，结合共聚焦成像、网格化切割、人工提取ROI凝胶块与PCR条形码索引建立ROI文库；最后，在数据分析层面，采用读段结构解析、UMI（unique molecular identifier，唯一分子标识）计数、降采样分析、Scanpy聚类、UMAP降维，以及与Allen Brain Atlas原位杂交图谱和公共RNA-seq数据进行参照验证。另在同一切片上整合了免疫荧光和RCA-FISH（rolling circle amplification-fluorescence in situ hybridization，滚环扩增荧光原位杂交）以支持图像引导的区域选择。
3.1. Development and validation of the GLASS-seq workflow
本部分主要介绍GLASS-seq流程的建立与基础验证。研究人员构建了一条完整的端到端流程，使组织切片中的RNA原位识别最终转化为可测序、可按ROI索引的文库。该系统的分子特异性由两个层面保证：其一，左右探针的双臂识别加连接“门控”机制，仅当两探针在同一RNA上正确邻接时才形成连续模板，从而抑制脱靶杂交背景；其二，带有acrydite修饰的锚定寡核苷酸共聚到凝胶网络中，使连接后的探针复合体固定在原位，在后续处理过程中维持空间保真性。研究人员进一步采用成像引导、网格化显微切割策略进行区域采样，通过切割前后成像实现信号配准，并利用乙醇诱导切口边缘轻微凝胶收缩，以便手工提取ROI凝胶块。Cy5标记的polyT探针实验表明，切割前后荧光信号保留良好，且与DAPI（4′,6-diamidino-2-phenylindole，细胞核染料）定位关系稳定；当锚定探针去除acrydite基团时，切片层面的Cy5信号消失，证明可聚合锚定对空间保留是必要的。组分缺失对照进一步显示，去除左探针、右探针、连接酶或锚定探针均会消除或显著减弱预期扩增条带，说明整个识别—连接—锚定循环具有封闭性和特异性。该部分结论是，GLASS-seq在常规实验室条件下即可完成稳定的原位识别、原位固定和后续空间采样，为后续定量分析奠定了方法学基础。
3.2. Robust read retention and region-wise concordance
本部分聚焦读段保留效率、区域表达保真度以及探针设计规律。研究人员使用17基因面板和16份样本评估端到端读段保留率，发现91.8%的原始读段在引物提取后被保留，81.7%满足全长探针标准，81.1%通过最终正确序列筛选，说明该连接型探针体系能够在常规条件下产生高比例的有效定量读段。随后，研究人员在8个脑区中分析159对探针、17个基因的区域表达模式，成功恢复了Cdhr1在OLF、Drd1在STR、Slc6a5在HB和CB等经典区域限制性表达特征，表明GLASS-seq具备较好的空间保真度。两张独立脑切片的技术重复性很高，区域表达矩阵之间Pearson相关系数达到0.994。与Allen Brain Atlas的原位杂交参考数据比较后也显示较好一致性，说明GLASS-seq能够重现实证性空间表达趋势。研究人员还发现，探针靶区GC含量和在转录本中的位置会影响性能：GC含量在35%–65%时，探针对准确性和捕获比例维持较好，而≥65%时明显下降；在转录本内部，靠近5′端和3′端的探针捕获效率偏低。该部分说明，GLASS-seq不仅具有稳定的读段保留与区域一致性，还给出了可直接用于面板设计的经验约束。
3.3. Brain-wide region-specific signatures resolved by GLASS-seq
本部分评估了GLASS-seq在全脑尺度的通量和空间分辨能力。研究人员对一张小鼠矢状位脑切片采用500 × 500 μm网格采样，并结合成像引导切割，对212个ROI使用731基因靶向面板进行分析。无监督分析结果显示，UMAP（uniform manifold approximation and projection）可分辨9类ROI，并且这些类别在组织坐标中投影后形成与大体神经解剖结构一致的连续区域。聚类标志基因也支持这些注释，例如小脑对应Gabra6、Neurod1，纹状体对应Drd1、Drd2，皮层对应Slc17a7、Fhl2，后脑对应Slc6a5、Glra1，中脑对应Pou4f1、Ace，另有海马、丘脑、下丘脑和嗅球等相关特征。该结果表明，GLASS-seq无需预先输入解剖标签即可恢复脑范围内的空间分子结构域。研究人员进一步以公共皮层bulk RNA-seq数据进行定量参照，并以Allen ISH图谱对Drd1、Chrm1、Cbln3、Lef1等基因的空间分布进行验证，结果均显示较好一致性。原始计数与UMI计数之间高度相关（r = 0.993），提示探针特异性扩增偏差较小。通过降采样分析，研究人员发现即使在较低测序深度下，高丰度和中丰度基因的空间模式仍可较好保留，且1 Gb数据量下仍能重建主要ROI类别。代表性的212个ROI脑切片实验，每张切片的经常性成本为512.2美元，即每个ROI约2.42美元。该部分结论是，GLASS-seq能够以适中的测序预算和较低单位成本，在全脑尺度恢复可解释、连续且符合解剖学的空间表达格局。
3.4. Same-section multimodal integration with IF and RCA-FISH
本部分验证GLASS-seq与同切片多模态成像的兼容性。为获得组织学背景信息，研究人员首先将polyT通道与免疫荧光联用，在小鼠冠状脑切片上同时获取RNA密度、GFAP（glial fibrillary acidic protein，星形胶质细胞标志）和CD31（内皮细胞标志）信号，获得共配准的空间图谱。该设计使研究者能够根据细胞类型或血管特征，在测序前完成图像引导的ROI选择。随后，研究人员又将GLASS-seq与RCA-FISH联用，在同一组织上同时观察Slc17a7和Slc17a6的单分子原位信号及polyT背景，所见空间分布与Allen ISH参考一致。补充实验还显示，在凝胶锚定之后进行RCA能够在保留锚定空间信号的同时，维持足够的RCA-FISH信号强度，适用于后续图像引导采样。该部分说明，GLASS-seq不仅可用于测序定量，还可以与组织学和单分子成像信息集成，从而提升ROI选择的可解释性。
3.5. High-plex, reproducible profiling across organs
本部分考察GLASS-seq跨器官应用的通用性和高重数面板条件下的表现。研究人员将相同流程扩展至心、肝、脾、肺、肾组织，并采用1,500基因面板进行分析。切割后的DAPI图像显示，不同器官中网格边界清晰、ROI提取稳定，说明该方法对不同组织结构具有较好的适应性。在高重数条件下，读段从原始数据到有效探针读段的保留率依然较高，原始计数与UMI计数保持紧密相关（r = 0.981），提示计数均匀性较好。进一步的探针层面分析显示，在1,500基因面板检测到的4,420对探针中，中位错误连接率为0.290%，但部分低UMI探针会呈现较高的表观百分比误差，因此误差解读需结合绝对UMI支持度。技术重复方面，每个器官两份样本经Ubc、Gapdh、Actb标准化后均表现出较高一致性，Pearson相关系数分别为心0.954、肾0.957、肝0.949、肺0.959、脾0.933。无监督分析可将15份样本清晰分为5类，对应5个器官；器官富集标志基因也与组织类型相一致。此外，在肾脏皮质—髓质—皮质轴和心脏基底部—心尖轴上，GLASS-seq还能检测到符合预期的粗尺度空间梯度。该部分表明，GLASS-seq在多种软组织中具备良好的可迁移性、重复性和高重数区域分析能力。
讨论部分总结显示，GLASS-seq通过将双臂分子识别、SplintR介导连接、水凝胶锚定和最简PCR条码化整合为统一框架，构建了一种低成本、图像引导、ROI索引化的靶向区域空间转录组平台。与高分辨率成像平台相比，该方法以较低空间分辨率换取更低专用设备成本、更小数据体量和更低单样本消耗；与无偏测序流程相比，它将测序深度聚焦于预定义基因面板，提高了对选定靶标，尤其是低丰度RNA和非编码RNA的有效检测能力。论文同时指出，该平台并非用于替代高精度或不规则边界的激光显微切割（LCM），而是面向多样本、多ROI、靶向区域表达分析场景的实用方案。其当前局限在于ROI选择、凝胶块收集及逐ROI建库仍以手工操作为主，可能制约更大规模队列研究中的吞吐量与重复性。未来改进方向包括自动化图像引导采样、坐标配准式打孔收集、板式条码PCR和自动化液体处理，以及更精细尺度采样、扩增辅助分辨率提升和多组学扩展。
结论部分可译为：
GLASS-seq将空间RNA分析重新定义为一种原位生物传感策略，通过耦合双臂分子识别、SplintR介导连接、水凝胶锚定以及最简PCR条码化，以约100 μm分辨率提供低成本、图像引导、ROI索引化的靶向区域转录组读出。该平台适用于大队列、多ROI分析，也适用于在高分辨率空间组学或单细胞分析之前，对信息量丰富的样本或区域进行预筛选。在脑及多种器官中，该平台表现出高捕获保真度（≥99%正确探针对恢复率）、稳健读段保留（约81%正确序列）、较强重复性（r ≥ 0.98）以及针对严格阴性对照的高信号背景比，并能在适度测序预算和较低单ROI成本下恢复与解剖结构一致的空间区域。其与同切片免疫荧光和RCA-FISH的兼容性，使其能够实现图像引导且具可解释性的采样；而靶向面板设计则可将测序深度集中于预定义基因，并可通过调整分配给每个基因的探针对数量来调控特定低丰度靶标的捕获率。尽管SplintR/PBCV-1 DNA连接酶在体外能够高效连接RNA辅助配对的DNA寡核苷酸，但GLASS-seq在组织中的绝对捕获效率仍需在未来进一步校准，因为最终信号还受到探针可及性、杂交、锚定、扩增和测序深度等因素共同影响。
