滋肾健脾化瘀方通过GPR83–ADM2–AKT信号轴防治糖尿病视网膜病变与肾病

《Visual Neuroscience》：ZJHY formula protects against diabetic retinopathy and nephropathy via the GPR83–ADM2–AKT signaling axis

　　

摘要翻译：糖尿病视网膜病变（DR）与糖尿病肾病（DN）即使在血糖控制良好的情况下仍持续进展，这凸显了对非血糖依赖性保护策略的迫切需求。中医药凭借其多成分、多靶点的整体调节优势，提供了独特的解决方案。本研究探讨了“滋肾健脾化瘀”（ZJHY）方对DR和DN的保护作用及机制。在糖尿病大鼠模型中，ZJHY在不依赖于血糖控制的情况下，显著减轻了视网膜和肾脏损伤，改善了脂质代谢和肾功能，并降低了全身炎症。这种保护作用与逆转糖尿病诱导的孤儿受体Gpr83（G蛋白偶联受体83）的上调，以及恢复GPR83–ADM2（肾上腺髓质素2）–AKT（蛋白激酶B）信号轴的功能有关。体外机制验证表明，在高糖条件下，GPR83–ADM2–AKT轴的激活可诱导促炎巨噬细胞（M1）极化及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）等炎症细胞因子的分泌，而敲低GPR83可抑制此过程。此外，基于包括GPR83在内的枢纽基因，研究人员整合了多个人类数据集并应用机器学习方法，鉴定出一个稳健的五基因免疫标志物（Acvr1c、Tnfsf9、GPR83、Shc4、Ednra），其可作为DR与DN联合筛查和预测的准确工具。

**论文解读：滋肾健脾化瘀方通过调控GPR83–ADM2–AKT轴防治糖尿病视网膜病变与肾病的机制研究**

**一、研究背景与问题**
糖尿病（DM）已成为全球性流行病，预计到205年将影响约13.1亿人，给全球医疗系统带来前所未有的负担。糖尿病视网膜病变（DR）和糖尿病肾病（DN）作为常见的微血管并发症，分别是导致不可逆性失明和终末期肾病的主要原因。尽管降糖治疗不断进步，但DR和DN患者的临床结局仍然不佳。这一临床挑战根植于两个相互关联的难题：首先，疾病进展常独立于血糖控制而持续，且严重缺乏针对DR和DN共同致病通路的疗法；其次，由于DR和DN早期常无症状，现有筛查方法（如眼底检查和尿白蛋白检测）缺乏敏感性、便捷性及联合预警能力，通常导致诊断延迟。这种在早期检测和基于机制的治疗方面的双重不足，凸显了识别联合治疗新分子靶点以及开发DR与DN早期联合筛查创新策略的迫切需求。DR和DN的发病机制以代谢失调、全身炎症与靶器官损伤之间复杂的相互作用为特征。持续高血糖导致视网膜和肾组织缺血缺氧，触发活性氧（ROS）等促炎刺激物的过量产生，并激活促炎信号级联反应。在此过程中，巨噬细胞作为关键的固有免疫效应细胞，其功能极化状态至关重要。巨噬细胞通常有两种表型：经典的促炎M1极化表型或替代的抗炎M2极化表型。慢性高血糖环境诱导巨噬细胞向M1型极化，导致M1/M2巨噬细胞动态平衡失调，释放过量的促炎细胞因子，促进视网膜和肾组织炎症微环境形成，最终损害微血管。因此，调节巨噬细胞极化已成为治疗DR和DN等糖尿病微血管病变极具前景的关键策略。G蛋白偶联受体（GPCRs）是人体内最大的膜受体家族，也是目前超过³0%临床药物的靶点，是细胞感知外部环境（如激素、神经递质）并将其转化为细胞内生理反应的关键分子开关。新证据强调了GPCRs在整合代谢与免疫信号中的作用，使其成为代谢性疾病有前景的治疗靶点。多项证据表明，GPCRs可能是连接糖代谢紊乱、炎症反应与视网膜及肾脏微血管损伤的关键枢纽，代表了DR和DN的共同靶点。为识别此类潜在靶点，研究人员通过对糖尿病大鼠视网膜和肾组织的转录组分析，筛选出在两个组织中均显著上调的GPR83。尽管GPR83目前仍是一个孤儿受体，但新线索提示其潜在意义：它与胸腺来源的调节性T细胞功能及炎症相关，并据报道在药物诱导的耳毒性模型中可与AKT信号通路相互作用。研究发现肾上腺髓质素₂（ADM2）可影响巨噬细胞极化，且与眼部和肾脏疾病密切相关；其下游信号通路包括AKT信号通路。鉴于AKT通路是糖尿病微血管并发症的核心节点，这些线索引出了一个引人注目但尚未验证的假说：GPR83可能通过ADM2激活AKT，驱动巨噬细胞极化，从而导致DR和DN的共病。

**二、研究目的与方法概述**
因此，本研究旨在：（1）确立GPR83作为DR和DN的共同致病枢纽，并描述其与ADM2–AKT通路的功能联系；（2）阐明GPR83–ADM2–AKT信号轴驱动巨噬细胞M1型极化的因果机制，并评估ZJHY靶向该轴的疗效；（3）基于包括GPR83在内的关键基因构建用于DR和DN早期联合筛查的人工智能（AI）诊断模型，将机制见解转化为临床应用。为达成这些目标，研究人员运用了多种关键技术方法。首先，建立了链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠模型，动物来自广东医学实验动物中心，并随机分为正常对照组、糖尿病组和ZJHY治疗组。ZJHY由黄芪、葛根、地黄、桃仁、山茱萸、三七、大黄、山楂、鸡血藤、石决明、僵蚕、乳香等中药组成，经水煎、浓缩、冻干制成。其次，采用了细胞培养实验，包括使用BV₂小鼠小胶质细胞系和通过腹腔灌洗分离的大鼠原发性腹膜巨噬细胞（PEMs），并在高糖条件下进行干预。第三，运用了多种分子生物学技术：通过苏木精-伊红（H&E）染色和免疫组织化学（IHC）评估组织病理学变化；通过免疫荧光染色检测巨噬细胞标志物（如Iba₁、Arg₁）和紧密连接蛋白（如occludin）；通过蛋白质印迹法（Western blot）分析GPR83、ADM2、AKT、磷酸化AKT（p-AKT）、PI₃K、BAX、BCL₂等蛋白表达；通过定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）检测相关基因的mRNA表达水平；通过酶联免疫吸附试验（ELISA）测定血清炎症因子浓度。第四，进行了基因功能操作：使用小干扰RNA（siRNA）敲低Gpr83或Adm2基因，以及使用质粒过表达Gpr83基因。第五，开展了转录组学分析：对大鼠视网膜和肾组织进行RNA测序（RNA-seq），识别差异表达基因（DEGs），并进行基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。第六，构建了AI预测模型：从基因表达综合数据库（GEO）获取人类DR和DN的转录组数据集，整合后进行差异表达分析、加权基因共表达网络分析（WGCNA），并与免疫相关基因（IRGs）取交集得到候选基因；随后应用最小绝对收缩和选择算子（LASSO）回归、支持向量机（SVM）和随机森林（RF）三种机器学习算法进行特征选择，筛选出核心基因特征；最后使用包括朴素贝叶斯（NB）、随机森林（RF）、支持向量机（SVM）等七种算法构建预测模型，并在独立验证集中评估性能。此外，还采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）对ZJHY提取物进行了化学成分分析。所有数据均使用GraphPad Prism进行统计分析，采用t检验或方差分析（ANOVA）等。

**三、研究结果**
**ZJHY对糖尿病大鼠视网膜和肾功能具有协同保护作用**
在STZ诱导的糖尿病大鼠模型中，ZJHY治疗虽未显著改善空腹血糖或体重，但显著降低了糖尿病大鼠血清促炎细胞因子（如IL-6、IL-1β）水平，改善了血脂异常（降低甘油三酯TG和总胆固醇TC）和肾功能障碍（降低尿素UREA和肌酐CREA）。H&E染色显示，糖尿病组大鼠视网膜和肾脏出现明显的病理损伤，而ZJHY治疗显著减轻了这些损伤，使组织结构更接近对照组。UPLC-Q-TOF/MS分析鉴定出ZJHY提取物中的₈5种化合物，包括酚酸、黄酮类、萜类、人参皂苷等，为其药理活性提供了化学基础。这些结果表明，ZJHY在不干扰全身糖代谢的情况下，对糖尿病条件下的视网膜和肾组织均发挥协同保护作用。

**ZJHY减轻糖尿病视网膜和肾脏中M1巨噬细胞极化与炎症**
免疫荧光染色显示，ZJHY治疗显著提高了视网膜中Arg₁⁺/Iba₁⁺比值，反映了M1型巨噬细胞极化减少。qRT-PCR结果显示，在糖尿病组中，视网膜和肾脏的M1标志物CD₈6 mRNA水平升高，而M2标志物CD₂06 mRNA水平降低；ZJHY治疗逆转了这些变化。同时，ZJHY下调了促炎因子（Il-6、Il-1β、Tnf-α）的mRNA表达，并上调了抗炎因子Il-₁0的表达。此外，ZJHY还降低了视网膜和肾脏中促凋亡蛋白BAX与抗凋亡蛋白BCL-₂的比值，表明其能减轻细胞凋亡。这些数据表明，ZJHY通过抑制巨噬细胞M1极化、减少炎症因子分泌和抑制凋亡通路，保护视网膜和肾脏免受糖尿病损伤。

**GPR83被鉴定为糖尿病视网膜病变和肾病的共同致病靶点**
对糖尿病大鼠视网膜和肾组织的转录组分析发现了一组在两个组织中表达模式一致且可逆的核心基因。功能富集分析显示，这些基因显著富集于细胞因子活性及细胞因子介导的信号通路等术语。进一步分析识别出三个基因（Gpr83、Hrk、Ubash3a）在糖尿病条件下在两个器官中均显著上调，而在ZJHY治疗后显著下调。其中，GPR83作为一个GPCR，在代谢和免疫调节中可能扮演关键角色。

**ZJHY逆转糖尿病诱导的视网膜和肾组织中GPR83的上调**
免疫组化、qRT-PCR和蛋白质印迹结果一致证实，GPR83在糖尿病大鼠的视网膜和肾组织中表达上调，而ZJHY治疗能有效逆转这种上调。这表明GPR83可能是介导ZJHY对糖尿病视网膜和肾病变改善作用的关键治疗靶点。

**ZJHY逆转糖尿病诱导的视网膜和肾组织中ADM2和AKT的上调**
研究发现，糖尿病条件下，视网膜和肾组织中Pi₃k、Akt的mRNA水平以及ADM2、PI₃K、磷酸化AKT蛋白水平均上调，而ZJHY治疗能逆转这些变化。有趣的是，Adm2 mRNA在糖尿病条件下表达降低，但经ZJHY治疗后得以恢复。这些发现强烈提示，ZJHY通过涉及GPR83、ADM2和AKT的机制治疗DR和DN。

**ZJHY通过GPR83–ADM2–AKT轴抑制巨噬细胞促炎因子分泌和凋亡**
体外实验在BV₂细胞和原发性腹膜巨噬细胞中验证了该轴的功能。在高糖条件下，过表达Gpr83进一步增强了AKT和ADM2的上调以及促炎因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）的分泌，而ZJHY处理可减弱这种效应。相反，敲低Gpr83或Adm2则抑制了高糖诱导的AKT、ADM2上调和促炎因子分泌，并减少了细胞凋亡。在原发性腹膜巨噬细胞中，敲低Adm2下调了AKT表达但不影响GPR83，证实ADM2位于GPR83下游。这些结果表明，GPR83–ADM2–AKT信号网络协同驱动巨噬细胞极化并促进炎症因子分泌，而ZJHY通过调节该轴发挥抗炎和抗凋亡作用。

**构建糖尿病视网膜病变和肾病的预测模型**
通过整合人类DR和DN的公共转录组数据集，并应用WGCNA和机器学习算法，研究人员从11个免疫相关候选基因中筛选出一个稳健的五基因免疫标志物：Acvr1c、Tnfsf9、GPR83、Shc4、Ednra。使用这五个基因构建的预测模型中，Cancerclass算法在DR和DN的独立验证集上分别取得了₀.93和₀.92的曲线下面积（AUC），表现出最高的诊断准确性。该模型为DR和DN的早期联合筛查提供了新的非侵入性工具。

**四、讨论与结论**
**讨论部分总结：**
本研究在糖尿病微环境中发现了一条新的GPR83–ADM2–AKT信号轴，该轴通过调节巨噬细胞极化，驱动了DR和DN共同的炎症发病机制。动物实验表明，GPR83及其下游ADM2–AKT通路在糖尿病大鼠的视网膜和肾组织中共同上调，而ZJHY对视网膜和肾脏的多靶点保护作用与下调该轴密切相关，提示靶向GPR83–ADM2–AKT级联反应可能是ZJHY对DR和DN产生协同疗效的基础。此外，研究人员构建了一个包含GPR83等五个免疫相关基因标志物的AI诊断模型，用于DR和DN的早期联合筛查。
GPR83作为GPCR家族成员，本研究首次证明其在DR和DN的病理过程中起核心驱动作用。其在两个不同靶器官中的协同上调表明它充当了糖尿病微血管损伤的共同驱动因子，而非器官特异性介质。这为开发针对多种糖尿病微血管并发症的广谱保护疗法提供了新靶点。
研究首次在特定病理环境中将GPR83与ADM2–AKT联系起来。体外功能实验支持GPR83–ADM2–AKT信号网络的存在，并明确了GPR83位于ADM2上游。ADM2在本研究的慢性高血糖微环境中发挥促炎作用，这与先前急性炎症模型中ADM2抑制M1极化的报道形成对比，可能反映了病理微环境的差异及ADM2在炎症调节中的双向性。
值得注意的是，ZJHY虽不直接调节糖尿病大鼠的血糖或体重，但对靶器官产生了重要的保护作用，包括改善血脂代谢、恢复肾功能、减轻病理损伤并抑制全身炎症。这体现了中药复方多通路同时调节的特点。ZJHY已作为院内制剂（Z₂0071182）在临床上应用多年，先前临床研究也支持其对DR和DN患者的疗效，增强了本研究发现的转化相关性。
通过WGCNA和机器学习算法鉴定的五基因免疫标志物（Acvr1c、Tnfsf9、GPR83、Shc4、Ednra）能够高精度预测DN和DR，捕获了微血管并发症早期免疫代谢失调，提供了超越传统标志物的预测价值。其中包含GPR83，在疾病发病机制与诊断之间建立了直接联系。
本研究也存在一些局限性：在机制验证的完整性方面，缺乏体内遗传或药理学拯救实验来最终确立上游-下游关系；由于ZJHY成分复杂，其直接活性成分尚未确定；五基因诊断标签需要在未来的前瞻性、多中心、大规模真实世界临床队列中进一步验证其普适性和稳定性；此外，BV₂细胞与原发性巨噬细胞在部分分子读数上存在差异，可能反映了细胞类型特异性或实验条件的影响，但核心机制结论得到了多方面的证据支持。

**研究结论翻译：**
总之，本研究系统探讨了新型GPR83–ADM2–AKT信号轴在糖尿病并发症中的致病作用和治疗潜力。ZJHY可能通过靶向该轴来治疗DR和DN，从而弥补当前独立于血糖控制的糖尿病微血管并发症疗法的空白。同时，开发了一个基于五基因免疫标志物的AI诊断模型，用于DR和DN的联合早期筛查。这些发现加深了对糖尿病微血管损伤分子机制的理解，并为将GPR83靶向策略和ZJHY转化为临床应用提供了理论基础。