《Current Research in Parasitology & Vector-Borne Diseases》：DNA barcoding Diplostomum (Digenea: Diplostomidae) through the lens of taxonomy: Status and issues
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分子条形码技术正在引发研究人员对大量复殖吸虫科（Digenea）物种多样性认知的根本性变革。然而，经过16年的条形码研究，针对双吸虫科（Diplostomidae）中物种最丰富的双吸虫属（Diplostomum）——该属包含重要的鱼类病原体——的全球性覆盖和分
分子条形码技术正在引发研究人员对大量复殖吸虫科（Digenea）物种多样性认知的根本性变革。然而，经过16年的条形码研究，针对双吸虫科（Diplostomidae）中物种最丰富的双吸虫属（Diplostomum）——该属包含重要的鱼类病原体——的全球性覆盖和分类多样性清晰图景远未实现。本文聚焦分类学视角，系统综述了2009—2025年间该领域的重要进展，更新了迄今已获得条形码的49个物种及物种级谱系的分类学与命名法，评估了当前若干热点领域的研究进展，包括物种丰富度与分类多样性、地理分布、生活史、宿主特异性以及条形码数据库的现状，并识别了数据使用和解释中存在的问题，这些问题可能影响未来的研究工作。
2. 早期分子研究
早期双吸虫属（Diplostomum）的分子研究提供了核糖体rRNA基因簇内部转录间隔区1（ITS1）的序列数据。Niewiadomska和Laskowski（2002）对波兰采集的幼虫期（主要为尾蚴）标本进行测序，鉴定了6个物种，但后续研究发现该研究将光鸫双吸虫（D. spathaceum）与小腹双吸虫（D. parviventosum）的ITS1序列鉴定为相同，引发了分类争议。Galazzo等（2002）对北美三个物种进行了ITS1-5.8S-ITS2测序，发现种间分歧范围为1.7%–4.4%，但未能区分"模糊双吸虫"（D. indistinctum）中的隐存种。该研究还发现北美与欧洲标本在ITS1序列上存在"意外"差异，暗示地理隔离导致的遗传分化。后续基于ITS标记的研究包括Rellstab等（2011）开发焦磷酸测序方法、Haarder等（2013）对丹麦尾蚴分离物的测序，以及Lebedeva等（2020）对蒙古拟囊蚴的研究。Georgieva等（2013）通过比较分析澄清了D. paracaudum与D. spathaceum的同物异名关系，并建立了可疑分支（Clade Q）。Faltynková等（2014）进一步更新了分析框架，对大量历史序列进行了重新归类。总体而言，ITS1及其相关区域由于种内变异、种间分歧低以及缺乏条形码间隙（barcoding gap），被认为不太适合双吸虫属的物种鉴定。
3. 十六年条形码研究历程
Moszczynska等（2009）首次采用针对双吸虫科设计的细胞色素c氧化酶亚基1（cox1）"条形码基因"特异性引物，为7个物种生成了序列数据，标志着双吸虫属DNA条形码研究的开端。截至本文综述，共有46项分子调查被纳入分析，其中41项报告了cox1序列，部分研究同时测定了完整的ITS rDNA序列（17项）或28S rRNA基因序列（6项），3项研究描述了5个物种的线粒体基因组。经过16年的发展，cox1序列已广泛应用于双吸虫属物种及物种级谱系的界定，相关数据同时支持基于种群/生活史阶段尺度的生物多样性研究以及属内系统发育关系的评估。
4. 物种数量评估
cox1条形码研究的物种累积曲线显示，前五年呈陡峭增长态势，随后十年增长趋缓。在41项调查中，共界定了49个物种或物种级谱系。调查规模差异显著：61%的调查仅涉及1–3个物种，32%涉及4–10个物种，仅3项调查涉及10个以上物种（最多达24个物种）。地理分布上，欧洲（25项）和北美（12项）占据了绝大多数调查，亚洲（4项）、非洲和南美洲（各2项）明显不足。物种检测概率极不均衡：31%的物种/谱系仅在单一调查中被记录，27%在两项调查中被记录，仅D. spathaceum（14项）和D. pseudospathaceum（13项）在超过10项调查中出现，这种分布反映了采样努力和地理/宿主覆盖度的异质性偏差。
5. 物种界定：分类学视角
5.1 重要进展
Locke等（2010a, b）首次针对北美双吸虫属开展了大规模条形码研究，从20种鱼类和1种两栖类宿主中检测到12个物种，确立了cox1序列优于ITS标记用于物种界定的结论。Locke等（2015）进一步扩展了数据库，整合了北美、欧洲和亚洲的数据，涵盖6个命名种和18个物种级谱系。
欧洲的首批条形码研究由Georgieva等（2013）、Blasco-Costa等（2014）和Pérez-del-Olmo等（2014）完成，表征了11个物种或谱系，分子阐明了模式种D. spathaceum和D. pseudospathaceum的生活史，并界定了"D. baeri"、"D. huronense"、"D. mergi"及"Diplostomum sp. Clade Q"四个复合群。Blasco-Costa等（2014）在冰岛的研究整合了基于特征的方法、系统发育分析、遗传分歧估计、活体幼虫形态学、微生境特化和宿主利用精确检测，发现至少有6个物种在该地区完成生活史。
Achatz等（2022）的研究通过全球采样和形态-分子整合方法，为15个物种/谱系（10个命名种和5个谱系）提供了28S rRNA和cox1序列数据，显著扩展了形态学鉴定的成虫阶段序列数据。该研究做出了一系列重要分类决策：将D. mergi alascense提升为独立种D. alascense；恢复了Paralaria alarioides和未鉴定吸虫（Diplostomum sp. VVT3）在双吸虫属内的分类地位；指出Diplostomum sp. VVT5与D. ardeae的形态差异，认为其代表一个尚未描述的物种；基于cox1和形态数据，确认D. huronense sensu Galazzo等（2002）和D. indistinctum sensu Galazzo等（2002）代表不同的谱系；将Diplostomum sp. 1和sp. 4分别与D. huronense和D. indistinctum建立同物异名关系；提出北美鉴定的D. baeri及相关谱系实际上可能代表一个新种。
5.2 当前cox1数据库：现状与问题
截至2025年11月，NCBI GenBank数据库收录了1452条双吸虫属cox1序列，生命条形码数据系统（BOLD）公开了2564条记录（2468条cox1、80条ITS、12条18S rDNA和4条28S rDNA序列）。BOLD数据存在明显的不一致性：两个不同网页显示的物种数分别为169和151，且大多数记录实际上是基于谱系或序列标签而非正式物种名，如"Diplostomum sp. 1"至"sp. 19"、"Diplostomum sp. A"至"sp. C"等。同一物种级谱系在BOLD中常被赋予多个不同标签，如Diplostomum sp. 1对应"Diplostomum sp. 1 SAL-2008"、"Diplostomum sp. 1"、"Diplostomum sp. 1 mag-2016"等。
BOLD的GenBank数据挖掘算法存在不可预测性，Achatz等（2022）发表的8个命名种和5个谱系的序列在发表近5年后仍未被BOLD收录，而部分未发表序列却被收入，导致近5年的时间滞后。McPhail等（2026）的序列同样未被及时挖掘。Sokolov等（2023）发表的D. numericum序列则有2年的滞后。这些问题的存在使得BOLD数据库中的分类信息过时且不可靠，直接影响新序列的鉴定结果。
GenBank虽然物种多样性覆盖更全面，但同样存在标签和定义未能反映当前分类状态的问题。因此，研究人员建议基于更新的命名法和参考序列建立预先整理好的内部条形码库，而非直接依赖BOLD或NCBI的原始数据。
6. 双吸虫属分类学与命名法更新
本综述更新了49个物种和物种级谱系的命名法，涵盖名称沿革、参考序列、原产地和主要宿主类群（螺类、鱼类、两栖类、鸟类和哺乳类）信息，并提供了BOLD的条形码指数号（BIN）对应关系。更新要点包括：纳入Achatz等（2022）测序的8个种和5个谱系；纳入McPhail等（2026）的2个新谱系（Diplostomum sp. 20和21）；指出9个蛋白酶B缺失的物种/谱系；标注9个单序列代表的物种/谱系；以及为11个命名种和16个谱系提供完整的同物异名信息。
基于231条cox1序列的系统发育分析（Kimura 2参数距离的邻接法）揭示了四个主要分支，与Blasco-Costa等（2014）的贝叶斯推断结果一致：两个晶状体感染种分支（含D. mergi复合群）和两个非晶状体眼感染种分支（含D. baeri复合群），后者尾蚴定位于眼玻璃体、视网膜或脑部。D. baeri复合群在多项分析中获得强支持，反映了自然的系统发育分组。
7. 警示：可疑鉴定与分类决策
7.1 D. baeri物种复合群
Lebedeva等（2022）对俄罗斯七鳃鳗脑部拟囊蚴的cox1测序显示，材料属于Diplostomum sp. Lineage 4，但将其命名为D. petromyzifluviatilis（裸名）引发争议：该名称长期作为裸名流传，Sweeting（1976）虽使其可用，但其描述的物种以非肺螺类螺为中间宿主，与当前材料不符；且作者未考虑部分材料此前已被鉴定为D. baeri的事实。Sokolov等（2023）对俄罗斯鲤科鱼类玻璃体液中拟囊蚴的测序，将材料鉴定为D. numericum（复活名），但基于幼期形态描述新种的做法本身存疑，且D. numericum与D. vitreophilum、D. gavium之间的历史同物异名关系复杂，材料实际上可能涉及至少三个共享该微生境的物种。两项研究的谱系鉴定均需等待成虫阶段的测序和详细形态分类学分析。
7.2 成虫鉴定：Faltynková等（2022）的"D. baeri"为何
Faltynková等（2022）对爱尔兰尾蚴和俄罗斯Karelia成虫的测序材料，在系统发育上归入Diplostomum sp. Clade Q，但作者将其成虫鉴定为"真正的"D. baeri，这一鉴定存在多重问题：仅基于5条测序蠕虫而非154条的完整样本；材料为死后收缩的劣质标本，不适合种级鉴定；与形态相似种的比较不充分，未考虑D. gobiorum等多种可能；所依据的"典型特征"（前体长于后体、卵黄腺分布等）均受固定条件影响且在多种类群中通用。综合其微小型拟囊蚴特征、系统发育位置及与D. mergi复合群的关联，该"真正的D. baeri"实为误鉴定的晶状体感染种，Diplostomum sp. Clade Q的确定鉴定有待新采集的、良好固定的成虫标本提供形态和分子证据。
8. 条形码地理学：我们是否已测序所有物种
大陆尺度上的答案取决于地理区域。历史记录显示全球共有69个双吸虫属命名种（ predominantly 二十世纪描述），其中欧洲最丰富（38个命名种/26个有效种），其次为亚洲（29/24）和北美（19/16），非洲、南极洲、澳洲和南美洲极少（1–2种）。
分子数据揭示了不同的模式：北美因采样密集而发现最多物种（26个谱系），超过历史记录，包括44%的命名种已有序列；欧洲仅16个谱系，相对26个有效种明显不足；亚洲更仅9个谱系。跨大陆分布的分子证据极少，欧洲与亚洲共享4种（D. mergi Lineage 2、D. pseudospathaceum、D. rauschi、D. spathaceum），亚洲与非洲共享2种（Diplostomum sp. 14和16），北美与南美洲仅1种（D. huronense）。目前无证据支持任何物种具有全北界分布。
生活史分子阐明方面，仅9个物种完全明确（北美5种、欧洲4种），部分明确的分布于北美（7种）和欧洲（5种）。仅北美有基于成虫的分子数据（4种），凸显了成虫阶段条形码的重要性。
宿主特异性研究显示，"专性"宿主特异性的概念很大程度上是采样不足和分类偏差的产物。更新数据表明，D. indistinctum（26种鱼类，10科）、D. huronense（25种，9科）、D. gavium（11种，7科）等原为"广食性"的物种宿主范围进一步扩大；而原认为的"专性"种如D. alascense（8种，5科）和D. adamsi（4种，3科）实际也具有较广的宿主范围。螺类中间宿主方面，15项调查的22个物种/谱系显示，11个北美种使用3种螺，11个欧洲种使用7种；宿主均属椎实螺科（Lymnaeidae），仅D. indistinctum和D. scudderi同时报告于扁卷螺科（Planorbidae）的Planorbella trivolvis。10个物种（45%）感染2种以上螺类，D. pseudospathaceum（4种）最多，Lymnaea elodes和A. balthica各支持9个物种，显示严格的单宿主特异性同样可能是采样限制的人工产物。
9. 未来展望
DNA条形码数据已证明在双吸虫属准确物种鉴定和遗传多样性评估中的价值，但其在生物监测中的主要应用尚待充分实现。双吸虫属幼虫阶段易于获取，是生态扰动（生物入侵、环境污染、全球变暖）的敏感指示生物，但完全普查的群落生态学研究和环境影响评估应用仍较少，通常将形态和分子鉴定数据合并处理。靶向宏条形码方法的出现可能革新该领域，已能检测高种内分子多样性和完整的区域物种多样性。
未来研究需在以下方面加强：第一，大幅增加采样努力，尤其针对非洲、亚洲、澳洲和南美洲；欧亚大陆有至少15个"遗漏"物种需纳入分子研究。第二，将条形码重心从不可靠鉴定的幼虫阶段转移到成虫阶段的系统搜索与形态-分子整合表征，Achatz等（2022）的研究已证明该途径的有效性。第三，持续进行数据整理，建立基于更新命名法的内部优质条形码库。第四，整合条形码与形态、生态和地理证据，推动双吸虫属的全球分类修订，并辅以28S rRNA（LSU）测序以改善科级以上分类系统。
10. 结论
16年的双吸虫属条形码研究揭示了显著的物种和中间宿主（主要是鱼类）多样性，但大量工作仍有待完成。研究重心需从单纯基于遗传数据的生物多样性发现，转向整合成虫形态数据与分子及生态证据的协调努力。Tkach、Achatz等同事在双口吸虫超科（Diplostomoidea）分类系统方面的显著进展，为建立现代"下一代"双吸虫属分类学提供了前景。
