《ACS Pharmacology & Translational Science》：Pharmacokinetics, Target Engagement of an Immunoproteasome Subunit Low-Molecular-Mass Polypeptide-2 (LMP2) Inhibitor AR-01, and Its Anti-Alzheimer’s Effects in Rodents
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此前，研究人员报道了AR-01（一种不可逆的大环肽环氧酮）能选择性抑制免疫蛋白酶体催化亚基LMP2（低分子量多肽-2）。研究还表明，在阿尔茨海默病（AD）动物模型中，抑制LMP2可通过抑制小胶质细胞介导的炎症产生抗AD效应。因此，AR-01正被开发为一种潜在的
此前，研究人员报道了AR-01（一种不可逆的大环肽环氧酮）能选择性抑制免疫蛋白酶体催化亚基LMP2（低分子量多肽-2）。研究还表明，在阿尔茨海默病（AD）动物模型中，抑制LMP2可通过抑制小胶质细胞介导的炎症产生抗AD效应。因此，AR-01正被开发为一种潜在的AD治疗方法。通常，具有肽骨架的中枢神经系统药物由于不利于穿过血脑屏障的特性而面临重大挑战。在本报告中，作为早期药物开发的一部分，研究人员在健康小鼠和大鼠中评估了AR-01的药代动力学特性，包括脑渗透性（即脑-血浆分配系数）。研究人员还使用两种替代方法验证了AR-01在脑中的靶点结合：（i）LMP2活性测定和（ii）Western印迹检测由不可逆的LMP2:AR-01加合物形成引起的LMP2条带迁移。结果证实，单次静脉注射AR-01可剂量依赖性地使小鼠脑中的LMP2失活。多次给药AR-01导致小鼠脑中LMP2加合物累积形成，并改善了5xFAD小鼠（一种广泛使用的淀粉样变性模型）的认知功能。综上所述，结果表明AR-01作为一种AD治疗药物具有有前景的药物特性。
**论文解读：免疫蛋白酶体亚基LMP2抑制剂AR-01的药代动力学、靶点结合及抗阿尔茨海默病效应研究**
**研究背景与意义**
阿尔茨海默病（AD）是一种以进行性认知功能下降为特征的神经退行性疾病，其病理机制复杂，涉及β淀粉样蛋白（Aβ）沉积、Tau蛋白过度磷酸化以及持续的神经炎症。近年来，针对淀粉样蛋白的清除抗体药物虽获FDA批准，但其疗效有限且存在淀粉样蛋白相关影像学异常（ARIA）等风险，凸显了开发新作用机制药物的迫切需求。神经炎症，特别是由小胶质细胞和星形胶质细胞介导的慢性炎症，被认为是AD进展的关键驱动因素之一，成为继淀粉样蛋白之后AD药物研发的第二大靶向过程。
免疫蛋白酶体是构成型蛋白酶体的替代亚型，主要在免疫细胞中表达或在促炎刺激下于非免疫细胞中诱导产生。其催化亚基包括LMP2（低分子量多肽-2）、MECL1和LMP7。研究表明，在AD等多种神经退行性疾病的动物模型和患者中，免疫蛋白酶体亚基LMP2和LMP7表达上调。选择性抑制免疫蛋白酶体，尤其是LMP2，在临床前模型中显示出改善认知功能的益处，提示LMP2是一个潜在的治疗靶点。然而，开发能够有效穿透血脑屏障（BBB）并作用于中枢神经系统的蛋白酶体抑制剂面临巨大挑战，因为许多肽类药物难以跨越BBB。
基于此，本研究聚焦于AR-01，一种由线性LMP2抑制剂YU-102优化而来的不可逆大环肽环氧酮类LMP2选择性抑制剂。前期研究显示，AR-01相比其线性类似物（如已获批的卡非佐米）具有更长的半衰期和更低的外排比率，但其系统的药代动力学（PK）特性、脑渗透性以及在脑内的靶点结合程度尚需全面评估。本研究旨在详细表征AR-01在小鼠和大鼠中的脑内处置过程，评估其靶点结合，并探索其在AD转基因模型中的初步疗效，以期为AR-01作为AD候选药物的开发提供关键依据。本研究发表在《ACS Pharmacology》上。
**关键技术方法概述**
本研究综合运用了药代动力学评估、靶点结合验证和动物行为学测试等方法。药代动力学研究在健康BALB/c小鼠和SD大鼠中进行，通过静脉注射（i.v.）给药，利用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定血浆和脑组织中的药物浓度，计算脑-血浆分配系数（K
p, brain）等参数。靶点结合评估采用两种互补方法：一是使用LMP2靶向荧光底物（Ac-PAL-AMC）的蛋白酶体活性测定法，量化LMP2活性抑制程度；二是通过Western印迹法检测由不可逆LMP2:AR-01加合物形成导致的LMP2条带迁移，直观反映共价修饰情况。此外，研究在AD模型动物（5xFAD转基因小鼠）中进行了探索性药效学评价，通过莫里斯水迷宫（MWM）测试评估空间记忆功能，并利用免疫组织化学技术分析星形胶质细胞形态变化。样本队列来源明确：健康小鼠和大鼠购自Jackson Laboratory；5xFAD小鼠来源于MMRRC（编号34848-JAX）。
**研究结果**
**1. AR-01在小鼠脑内的快速分布**
研究人员给健康BALB/c小鼠静脉注射高剂量（80 mg/kg）AR-01，并在早期时间点评估其脑分布。结果显示，AR-01在脑内可检测到长达1小时，其脑-血浆分配系数（K
p, brain）为0.017。从最早取样点（给药后5分钟）起，小鼠血液中的LMP2活性即被完全抑制，并持续至6小时。脑内LMP2活性也达到约70%的抑制，且在整个测试期间维持。Western印迹分析证实，给药小鼠脑内存在LMP2:AR-01加合物。值得注意的是，在给药后5分钟（即脑内药代动力学研究中达到峰浓度（T
max）的时间点），就已观察到完全的LMP2加合物形成和活性抑制，表明AR-01能迅速分布至小鼠脑内并立即与靶点结合。
**2. AR-01在大鼠中的药代动力学和靶点结合**
在SD大鼠中单次静脉注射40 mg/kg AR-01后，其药代动力学特征与小鼠相似：血浆峰浓度高，但半衰期短（t
1/2约28分钟），清除迅速（CL为3420 mL/h/kg），表现为高代谢和组织分布特性。血液中的LMP2活性被完全抑制。虽然脑组织匀浆的LMP2活性测定仅显示部分抑制，但Western印迹法在相同脑组织中检测到了LMP2的完全修饰（加合物形成）。活性测定进一步验证了AR-01对LMP2的选择性靶向，对其他蛋白酶体催化亚基的影响极小。
**3. 脑内AR-01靶点结合的剂量依赖性**
在健康BALB/c小鼠中进行的剂量反应研究表明，单次静脉注射不同剂量的AR-01能剂量依赖性地抑制小鼠脑内LMP2活性并促进加合物形成，在大约40 mg/kg时达到饱和，显示出优异的体内靶点结合能力。然而，脑内LMP2活性抑制程度与LMP2:AR-01加合物形成程度并不成比例，两者差异倍数约为2.5。分析认为，这可能与LMP2活性测定过程中，小鼠脑组织匀浆内存在非LMP2催化的荧光底物（Ac-PAL-AMC）水解有关。研究还发现，Western印迹上约70%的脑LMP2占有率可能相当于血液中至少90%的LMP2活性抑制，提示血液LMP2活性抑制可作为预测脑内AR-01靶点结合的快速、可靠的初级生物标志物。
**4. LMP2活性测定与条带迁移测定之间的非比例性靶点结合**
为深入理解两种靶点结合测定方法在小鼠和大鼠脑组织中观察到的差异，研究人员在鼠源小胶质BV2细胞中进行了剂量依赖性概念验证实验。结果同样显示，LMP2活性抑制程度与加合物形成程度不一致（例如，在50 nM AR-01时，60%的活性抑制对应90%的加合物形成），表明这种非比例性结果并不仅限于啮齿动物脑组织。进一步实验证实，在脑组织匀浆中，确实存在蛋白酶抑制剂混合物（PIC）可抑制的、非LMP2催化的Ac-PAL-AMC水解（约40%）。尽管两种测定结果存在差异，但当对两种方法得到的数值进行归一化处理后，它们具有可比性，表明AR-01和Ac-PAL-AMC与LMP2的结合机制相同。综上所述，由于底物的非LMP2催化水解，LMP2活性测定可能无法准确反映AR-01在啮齿动物脑内的靶点结合程度；而Western印迹法虽然是耗时的方法，但对于测量AR-01等LMP2抑制剂引起的共价LMP2失活更为合适。
**5. AR-01在鼠体内的多种给药途径**
评估了腹腔注射（i.p.）和口服（p.o.）给药途径。在健康小鼠中，AR-01腹腔注射（150 mg/kg）的生物利用度（F）粗略估计约为54%，并在给药后6小时的小鼠脑中观察到完全的LMP2:AR-01加合物形成，支持了腹腔注射作为小鼠药效学研究中可接受的给药途径。尽管先前报道AR-01在健康BALB/c小鼠中的口服生物利用度约为10%，本研究发现口服给药（150 mg/kg）能在小鼠脑内实现约71%的LMP2加合物形成。与静脉注射类似，腹腔注射和口服给药后，脑匀浆中也观察到了非比例性的靶点结合测定结果。这些发现表明，AR-01可通过多种途径给药，并具有良好的脑渗透性和靶点结合能力。
**6. 多次给药AR-01引起的LMP2累积占有率**
在老年C57BL/6小鼠（作为5xFAD小鼠的野生型对照）中，每周两次腹腔注射AR-01（20 mg/kg），持续三周。结果显示，尽管脑和血液中的LMP2活性抑制程度在长达4天内似乎保持不变，但在给药间隔期间（第3-4天）观察到游离LMP2水平的轻微反弹。在最后测试时间点（第21天），约46%的脑LMP2形成了AR-01加合物。这表明，在老年C57BL/6小鼠中，通过多次给药AR-01可以实现LMP2的累积占有率，这为在AD小鼠模型中药效学研究的剂量选择提供了依据。
**7. AR-01改善5xFAD小鼠的记忆功能并挽救反应性星形胶质细胞**
在5xFAD AD小鼠模型中进行了初步药效学评价。4月龄5xFAD小鼠接受AR-01（20 mg/kg，腹腔注射，每周两次）或对照剂治疗3周后，进行莫里斯水迷宫测试。尽管两组小鼠随着训练进展，寻找隐藏平台的能力均有所提高（逃避潜伏期每日缩短），但接受AR-01治疗的5xFAD小鼠表现优于对照组，尤其是在第4天和第5天。尽管小鼠数量有限，但在第4天观察到到达平台的距离存在显著差异（AR-01组更短）。此外，研究评估了AR-01对反应性星形胶质细胞的影响。在对照组5xFAD小鼠中，靠近Aβ斑块的星形胶质细胞表现出反应性星形胶质细胞的典型形态：更粗、分支更多。而AR-01治疗显著减少了星形胶质细胞分支的数量和连接点，提示其对反应性星形胶质细胞可能具有挽救作用。总体表明，AR-01有效抑制了5xFAD小鼠的病理生理过程。
**讨论与结论总结**
本研究的讨论部分首先强调了针对AD神经炎症开发新疗法的重要性，并将免疫蛋白酶体定位为一个控制神经炎症的新靶点。研究人员开发的LMP2选择性大环肽环氧酮AR-01，在啮齿动物中的初步药代动力学/药效学研究表明，其能通过多种给药途径迅速分布至脑内并有效靶向脑LMP2。靶点结合使用两种替代方法进行评估：基于LMP2靶向荧光底物的蛋白酶体活性测定法和检测LMP2:AR-01加合物的Western印迹法。据研究人员所知，这是首次证明蛋白酶体抑制剂能快速脑分布并验证其靶点结合的研究。研究还显示AR-01能改善5xFAD小鼠的记忆功能并挽救反应性星形胶质细胞。
与半衰期长、清除率低的传统药物不同，肽类环氧酮蛋白酶体抑制剂家族（如卡非佐米、奥普佐米）虽然半衰期短、清除率高，但通过共价修饰蛋白酶体催化亚基的N-末端苏氨酸残基，实现了持久的靶点结合和药效学效应。大环结构的AR-01作为该家族的最新成员，同样表现出延长的靶点结合（3-4天）和改善的药代动力学特性。其在脑内的LMP2占有率不仅持久，还能通过重复给药累积。因此，AR-01的药代动力学特性与其药效学反应并非直接关联。
关于靶点结合评估方法，研究指出，使用Ac-PAL-AMC的蛋白酶体活性测定法是一种快速测量LMP2抑制程度的高效方法，但必须考虑脑组织匀浆中存在的非LMP2催化底物水解，这可能导致活性读数人为升高，从而高估残留的蛋白酶体活性。相比之下，Western印迹法能检测不可逆抑制剂引起的LMP2共价修饰，虽然耗时，但能更准确地评估共价抑制剂的靶点结合程度。对于其他不可逆蛋白酶体抑制剂，使用其他亚基选择性荧光底物时，也可能需要仔细验证以调和抑制率与共价加合物形成程度之间的差异。
在药效学方面，与先前在其他AD模型（如Tg2576转基因小鼠）中使用其他LMP2抑制剂的研究结果一致，AR-01在5xFAD转基因小鼠中减轻了AD相关的行为障碍。尽管使用未优化的AR-01给药方案获得的效果令人鼓舞，但可能需要进一步验证以确认AR-01在优化剂量和间隔下的疗效。此外，莫里斯水迷宫测试是使用有限数量小鼠进行的初步研究，未来需要足够数量的队列以及评估潜在的性别依赖性治疗效应，以确立AR-01疗效的稳健性。
最后，研究显示，重复给予20 mg/kg AR-01（与体内药效学研究中使用的剂量相同）可实现最大约50%的累积脑LMP2修饰。鉴于有研究表明，卡非佐米需要至少抑制60%的蛋白酶体糜蛋白酶样（CT-L）活性才能达到理想的抗癌疗效，因此，研究约50%的脑LMP2抑制是否足以实现最大的抗AD疗效将是一个有趣的课题。更深入地了解暴露-反应关系并优化给药方案，可能在临床前和临床研究中产生AR-01的最佳疗效。
**研究结论（翻译）**：
总之，本研究提供了关于评估肽类环氧酮蛋白酶体抑制剂（包括AR-01）作为中枢神经系统候选药物的重要见解。AR-01表现出有前景的药代动力学特性和有效的脑靶点结合能力。在5xFAD小鼠模型中，AR-01改善了记忆功能并显示出对反应性星形胶质细胞的挽救作用。这些发现支持了进一步开发AR-01作为一种通过靶向免疫蛋白酶体LMP2亚基来调节神经炎症的潜在阿尔茨海默病治疗策略。
