《Frontiers in Immunology》：Hematopoietic monoamine oxidase A deficiency exacerbates neuroinflammation and demyelination in female but not male mice with experimental autoimmune encephalomyelitis
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单胺氧化酶A（Mao A）是一种负责降解单胺类神经递质的线粒体酶。尽管有报道指出药理学抑制Mao A可改善实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的预后，但Mao A在免疫细胞中对疾病进展的作用尚不清楚。为探究此问题，研究人员构建了造血细胞条件性Mao A敲除小鼠（
单胺氧化酶A（Mao A）是一种负责降解单胺类神经递质的线粒体酶。尽管有报道指出药理学抑制Mao A可改善实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的预后，但Mao A在免疫细胞中对疾病进展的作用尚不清楚。为探究此问题，研究人员构建了造血细胞条件性Mao A敲除小鼠（Mao ALeuko-/-），包括循环免疫细胞，并通过MOG35-55肽免疫诱导EAE，评估疾病严重程度、共济失调、炎症和脱髓鞘情况。结果显示，Mao ALeuko-/-雌性小鼠表现出体重下降显著加速、共济失调恶化以及EAE严重程度增加2.2倍。组织学分析显示Mao ALeuko-/-小鼠腰髓中炎症增加和脱髓鞘加重。免疫组化显示脊髓中IBA-1+和CD68+ [
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多发性硬化（MS）是一种病因复杂、多因素影响的神经系统疾病，主要累及中枢神经系统（CNS）。MS病灶特征包括炎症、胶质增生、脱髓鞘和/或神经退行性变，可影响中枢神经系统的白质和灰质。该病存在显著的临床异质性，且女性患者约为男性的三倍。女性与男性在先天性和适应性免疫方面存在明确差异，这与自身免疫病的易感性差异相关。在中枢神经系统中，小胶质细胞表现出性别特异性的转录和功能特征，影响神经炎症过程和疾病结局。MS及其动物模型EAE均表现出强烈的雌性偏倚，并受到性别依赖性神经免疫机制的调控。
MS被认为是一种自身免疫介导的中枢神经系统疾病，疾病不同阶段涉及适应性和先天性免疫系统的参与程度不同。早期复发-缓解期与抗原特异性T细胞和B细胞介导的适应性免疫反应相关，而进展期则与以慢性炎症和小胶质细胞激活为特征的先天性免疫反应相关。EAE是复制人类MS的成熟动物模型，其特征为髓鞘特异性T细胞在外周二级器官激活后迁移至中枢神经系统界面，经抗原提呈细胞（APC）再激活并克隆扩增以发挥其效应功能。除T细胞外，驻留小胶质细胞、中枢神经系统相关巨噬细胞（CAMs）以及浸润的单核细胞来源巨噬细胞（MDM）和中性粒细胞均参与MS/EAE病理发展。这些髓系细胞群体在MS病理发展中既发挥有益也发挥有害作用，其功能二象性可归因于小胶质细胞和巨噬细胞的不同激活状态，如促炎与炎症消退表型。因此，调控小胶质细胞/巨噬细胞反应对EAE结局至关重要，影响组织损伤与缓解之间的平衡。
单胺类物质因其能与两个系统中的细胞受体结合，对免疫系统和神经系统的双向相互作用至关重要。主要包括多巴胺（DA）、去甲肾上腺素（NA）和5-羟色胺（5-HT），由位于脑干的单胺能神经元产生。然而，EAE小鼠中枢神经系统中单胺类神经递质水平显著降低，提示其在MS和EAE发病机制中可能发挥关键作用。这些浓度变化不仅是定量发现，更具有功能意义，因为单胺类物质主动调节免疫和胶质反应。例如，NA主要通过作用于小胶质细胞和星形胶质细胞发挥强效抗炎和神经保护作用；5-HT调节先天性和适应性免疫系统，包括驱动巨噬细胞向炎症消退的M2样表型极化。NA、DA和5-HT均由单胺氧化酶A（Mao A）降解，Mao A是一种含FAD的酶，紧密结合于线粒体外膜，催化伯胺、仲胺和叔胺的氧化脱氨作用，包括进入血液并在其中积聚的膳食生物胺（如酪胺）和内源性神经递质，生成相应的亚胺，再水解为相应的醛或酮。Mao A在中枢神经系统特定区域和外周组织中均有表达，在脑中分布广泛，在去甲肾上腺素能神经元中高度表达。
Mao A也在免疫细胞中表达，特别是在单核细胞、巨噬细胞以及小胶质细胞中。外周白细胞通过血脑屏障和血脑脊 boards屏障进入中枢神经系统是MS的标志，这些免疫细胞可能导致MS相关的中枢神经系统单胺类神经递质耗竭。两项研究表明，Mao抑制剂苯乙肼可改善EAE小鼠的功能结局，无论在临床症状出现前给药还是已在出现EAE症状的小鼠中给药均有效。本研究旨在探究造血细胞中Mao A活性的基因删除是否会同等程度地减轻EAE疾病严重程度和躯体功能损害。鉴于单胺类神经递质如5-HT和DA在调节炎症反应和细胞因子产生中的重要作用，以及先天性和适应性免疫中公认的性别差异，研究人员预测造血细胞中Mao A活性的改变可能导致神经免疫相互作用和EAE发病的性别依赖性效应。
研究人员采用的主要技术方法包括：利用CRISPR/Cas9技术构建条件性Mao A敲除小鼠（Mao A
flox/flox），与Vav-iCretg/wt小鼠杂交获得造血细胞特异性Mao A敲除小鼠（Mao A
Leuko-/-），样本来源于C57BL/6J遗传背景的上述基因工程小鼠；通过MOG
35-55/完全弗氏佐剂（CFA）皮下注射联合百日咳毒素（PTX）腹腔注射诱导EAE模型；采用Western blot分析白细胞中Mao A蛋白表达以验证敲除效率；通过每日体重记录、临床评分（0-5分制）和共济失调评分（四项测试总和）评估疾病进程；对腰髓切片进行苏木精-伊红（H&E）染色评估炎症、Luxol Fast Blue（LFB）染色评估脱髓鞘；运用免疫荧光染色检测IBA-1（小胶质细胞/巨噬细胞标志物）、CD68（溶酶体活性标志物）和CD3（T unresolved 标志物）的表达，结合ImageJ软件进行图像定量分析。
**造血系统Mao A缺乏加剧EAE相关体重下降**：为明确造血系统Mao A在EAE中的作用，研究人员与Applied StemCell合作，利用CRISPR/Cas9技术在C57BL/6J背景下构建条件性Mao A敲除小鼠，并与Vav-iCretg/wt小鼠杂交获得Mao A
Leuko-/-小鼠。Western blot验证显示，Mao A
Leuko-/-小鼠白细胞中Mao A蛋白水平被抑制90%，且Mao B表达未代偿性增加。雌性Mao A
Leuko-/-小鼠自免疫后第14天开始体重下降，下降速度明显快于对照组，于第21天达到峰值，平均体重损失达22.5%，累计体重损失为对照组的2.2倍，表明造血细胞Mao A缺失反而加重雌性小鼠EAE严重程度。
**造血系统Mao A缺乏增加EAE疾病和共济失调严重程度**：MOG
35-55免疫后，两组雌性小鼠约在免疫后第13天出现EAE症状。对照组疾病严重程度于第19天达峰值（平均分1.6分），而Mao A
Leuko-/-组达3.4分，至第30天两组均值差异仍为1.4分。Mao A
Leuko-/-组累计EAE严重程度为对照组的2.2倍。共济失调评分变化趋势与之一致，Mao A
Leuko-/-组于免疫后第10天即出现可见躯体功能障碍，第16天平均评分达11分，而对照组仅为5分，累计共济失调严重程度为对照组的1.8倍。然而在雄性小鼠中，Mao ALeuko-/-与对照组在体重变化、EAE疾病严重程度和共济失调方面均无显著差异。值得注意的是，Vav-iCretg/wt对照组雄性小鼠的EAE病程和累计严重程度显著高于雌性对照组（2.4倍），这与广泛使用的MOG35-55诱导EAE模型中雌雄C57BL/6小鼠疾病进程相似的结果不同。
**造血系统Mao A缺乏增强EAE病灶内炎症并加速脱髓鞘**：腰髓组织病理学检查显示，Vav-iCretg/wt对照组EAE小鼠已存在广泛的白细胞浸润和炎症。Mao ALeuko-/-雌鼠白细胞浸润增加63%，提示炎症加重；同时髓鞘化区域减少26%，表明造血细胞Mao A活性丧失加速EAE小鼠脱髓鞘。
**造血系统Mao A缺乏加剧EAE小鼠中枢神经系统巨噬细胞和小胶质细胞激活**：为明确造血系统Mao A删除对MDM和小胶质细胞激活状态的影响，研究人员评估了IBA-1的表达。Mao ALeuko-/-小鼠脊髓切片中IBA-1+细胞增加，提示小胶质细胞/巨噬细胞激活增强，可能伴随MDM向CNS浸润增加，后者经CD68免疫染色证实。然而，两组间CD3+ T细胞水平无显著差异，表明雌性Mao ALeuko-/-小鼠加重疾病表型并非由T细胞招募增加驱动。
讨论部分，研究人员旨在探索免疫细胞Mao A对EAE发病、进展和严重程度的影响。研究发现造血细胞（包括循环免疫细胞）Mao A删除增加EAE疾病严重程度并加剧运动功能缺损，但仅限于雌性小鼠；雄性小鼠中未观察到类似效应。然而，雄性EAE小鼠（无论Mao A是否缺失）的疾病严重程度和共济失调程度与造血细胞Mao A缺失的雌性EAE小鼠非常相似，提示免疫细胞Mao A对雌性小鼠具有EAE保护效应，但雄性小鼠中不发挥类似保护作用。
研究人员推测性别差异的可能机制：一是Mao A参与雌激素信号传导，从而介导雌激素对神经炎症和氧化应激的保护作用。尽管有报道称雌激素抑制女性Mao A表达和活性，但小鼠中并非如此。此前在饮食诱导肥胖模型中的研究显示，雌性小鼠脂肪组织Mao A蛋白表达高于雄性，而活性无统计学差异，提示至少在小鼠中雌激素不抑制Mao A活性。且Mao A缺失的骨髓来源巨噬细胞（BMDM）中激活状态标志基因表达增强，支持Mao A调控 macrophage信号和激活的假说，Mao A源性H?O?可能通过靶向氧化还原敏感信号分子和转录因子介导此效应。二是去甲肾上腺素能控制小胶质细胞的互补轴：NA通过β2-肾上腺素能受体使小胶质细胞向抗炎激活状态极化，而Mao A参与NA分解代谢，造血细胞Mao A删除可能改变外周单胺处理和免疫-中枢神经系统 crosstalk，结合性别依赖性肾上腺素能受体表达和雌激素调控，共同解释EAE小鼠中观察到的雌性特异性Mao A活性缺失敏感性。
研究人员承认研究存在局限：Vav-iCretg/wt对照组雌雄小鼠EAE病程和严重程度存在差异，而通常MOG35-55诱导的EAE中C57BL/6雌雄小鼠疾病进程相似，推测Vav-iCre转基因可能是造成此差异的原因。该转基因在雄性睾丸中也有活性，可能导致生殖细胞中的重组；此外Vav-Cre/Vav-iCre株系也有报道在内皮细胞中表达Cre。
研究结论：本研究鉴定了Mao A在EAE发生发展中的新作用，以及可能促成包括慢性神经炎性疾病在内的、涉及巨噬细胞病理的性别差异的新机制。诱导巨噬细胞中Mao A表达的治疗策略可能代表女性MS患者或高危人群的新型（辅助）治疗途径。
