《Frontiers in Genetics》：Single-cell transcriptomic insights into the intrinsic cardiac nervous system: diversity, development, and neuro-cardiac interactions
心脏内在神经系统（intrinsic cardiac nervous system，ICNS）由嵌入心脏内部的交感、副交感及感觉神经元构成，在调控心脏电生理与收缩功能方面发挥关键作用。该网络的功能失衡是驱动心肌梗死、心力衰竭（heart failure，HF）、心房颤动（atrial fibrillation，AF）及高血压的核心机制之一。尽管相关研究已持续数十年，ICNS参与心血管疾病的确切病理生理学基础仍未得到充分阐明。传统的批量RNA测序（bulk RNA sequencing）只能测量混合细胞群体的平均基因表达，无法解析ICNS的细胞异质性，尤其难以识别稀有的神经元和胶质细胞亚群。因此，若干关键调控通路长期处于被遮蔽状态。单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）通过实现单细胞分辨率的转录谱分析，克服了上述局限。这一技术突破不仅细化了ICNS内部的细胞分类学框架，也揭示了支撑心脏-神经相互作用的动态分子网络。本文综述了单细胞分离、谱系追踪及空间转录组学（spatial transcriptomics）等方面的技术进展，并重点概述若干关键发现，包括心脏枢纽胶质细胞（cardiac nexus glia，CNG）的鉴定、致心律失常神经元亚型的识别，以及心血管疾病中的神经-免疫相互作用。同时，本文讨论了当前方法学瓶颈，以及数据整合、跨物种转化和临床应用方面的现实挑战，并提出有望弥合分子认知与治疗应用之间鸿沟的未来研究目标。
Introduction
文章首先从自主神经系统（autonomic nervous system，ANS）对内环境稳态维持的基础作用切入，指出其通过交感与副交感分支调控心脏收缩、血管张力、腺体分泌及内脏运动。其中，心脏内在神经系统（intrinsic cardiac nervous system，ICNS）被界定为嵌入心脏内部的局部神经调控中枢，负责心律、心肌收缩性及应激适应的精细调节。文中强调，交感激活产生正性变时与正性肌力效应，而副交感迷走通路则对心率和心肌收缩力施加抑制性调控。延髓疑核与迷走神经背运动核发出的神经元经迷走神经投射至心脏，是这一副交感调控轴的重要解剖基础。
在疾病关联层面，文章指出急性心肌梗死与慢性心力衰竭常伴随交感过度活化及迷走抑制，而心率变异性、压力感受器反射敏感性及血浆儿茶酚胺水平等临床参数可预测心肌梗死和心力衰竭患者的发病风险与死亡风险。对于心房颤动（atrial fibrillation，AF），作者进一步概述了肺静脉异位放电与交感/副交感纤维共定位及协同激活之间的关系，说明自主神经失衡是AF、高血压、心肌梗死和心力衰竭等多种心血管疾病的重要促发因素，并伴有神经重塑、神经递质表达改变以及支配异质性。
文章随后指出，尽管ICNS功能异常已被广泛关联于多类心血管疾病，但其发育过程中的细胞多样性及病理状态下的分子机制仍不清楚。传统转录组学虽提供了与ICNS功能异常相关的基因表达信息，但因只能反映混合细胞的平均信号，难以解析稀有细胞群与动态转录变化。单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）的出现改变了这一局面，使研究者能够识别新型细胞类型、重建谱系关系、分析细胞间通讯并提取疾病特异性转录特征。基于此，本文将近年的ICNS单细胞及空间转录组学研究整合为三个概念层面：发育起源与谱系决定、细胞多样性及神经-胶质-免疫组织结构、健康与疾病中的功能性神经-心脏相互作用，旨在推动对分子异质性如何影响电生理调控、适应性重塑与心血管病理的整合性理解。
Advances in single-cell sequencing for cardiac autonomic development
本部分聚焦单细胞技术如何促进ICNS发育轨迹的重建，并为谱系特化与细胞成熟提供新证据。文章的核心观点是，技术分辨率的提升直接拓展了对心脏自主神经发育的认知边界。
Progress in single-cell isolation and transcriptomic profiling
作者首先回顾了单细胞转录组学平台的发展路径。早期单细胞转录组测序依赖人工显微操作分离单个卵母细胞和卵裂球，虽然通量低且劳动密集，却首次揭示出单细胞层面的转录复杂性。随后，微流控平台迅速发展，Drop-seq与10x Genomics等技术使数千个细胞能够被同时包封并条形码标记，大幅提高了分析通量和效率。
文中将当前主流单细胞分离策略概括为三类：集成流体回路（integrated fluidic circuits，IFCs）、微孔阵列及液滴系统。IFCs适合从心脏等复杂组织中精准捕获稀有细胞；微孔方法通过将细胞分配至大量微小反应室以降低群体平均效应；液滴法则借助油包水乳液实现高通量、低成本分析，但在样本回收与下游数据处理中具有一定挑战。技术更新推动了心脏转录组研究的快速发展。文中列举了胚胎小鼠心肌细胞单细胞时序图谱、健康与病变心脏中病理性成纤维细胞和心肌细胞亚群的识别等代表性成果。
尤其重要的是，研究者结合scRNA-seq与单分子荧光原位杂交（single-molecule fluorescence in situ hybridization，smFISH），绘制了E10.5至P7多个发育阶段的心脏神经嵴细胞衍生谱系图谱。该研究解析了超过34,000个心脏神经嵴来源细胞，证明其可分化为心脏周细胞与微血管平滑肌细胞，提示其构成除心外膜和内皮来源之外的第三类心壁细胞来源。文章认为，这一发现不仅拓展了正常发育认知，也为DiGeorge综合征和CHARGE综合征等相关畸形的研究及心脏修复潜力评估提供了新方向。
Lineage-tracing innovations for developmental reconstruction
在谱系追踪方面，文章指出传统染料注射或荧光标记结合人工克隆分析的方法存在通量低、标记持续时间短等不足。随着遗传条形码策略与scRNA-seq的整合，研究者得以在单细胞分辨率上重建发育谱系。此类方法通过在祖细胞中引入可遗传DNA条形码，并经高通量测序读出其编辑状态，从而推断不同细胞状态之间的发育关系。
目前多数策略基于CRISPR-Cas9条形码记录体系，但仍存在条形码捕获效率低、编辑不完全、趋同突变等问题。为此，文中介绍了DuTracer这一双核酸酶谱系记录平台，其同时使用Cas9与Cas12a系统，以提高谱系树深度与多样性。该体系在HEK293T细胞、小鼠胚胎干细胞、拟胚体及神经-中胚层类器官中的验证表明，神经-中胚层祖细胞对神经命运与中胚层命运具有不同偏向。尽管DuTracer尚未在体内ICNS中应用，作者认为其为追踪心脏-神经谱系关系提供了新的概念工具，并提出未来可通过与光响应启动子结合以提高时间控制精度，也可与人类类器官模型结合以解析人类特异性的心脏自主神经发育。
Spatial and multimodal platforms enabling cardiac neuro-anatomical mapping
文章进一步强调，空间背景是理解细胞通讯不可或缺的维度，因此scRNA-seq与空间转录组学（spatial transcriptomics）的联合成为重要前沿。人类胚胎心脏器官尺度图谱的建立，为发育中心脏的空间基因表达研究奠定了框架。斑马鱼心脏再生的四维时空图谱则显示，将Stereo-seq与scRNA-seq联合应用，可在组织修复过程中识别特异性分子程序，这一技术范式同样适用于ICNS研究。
对于成熟神经元在常规液滴测序中易于丢失的问题，文章介绍了单核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing，snRNA-seq）。该方法通过分析核RNA避免了组织解离引起的应激响应，尤其适合存档或冷冻样本以及体积较大的神经细胞。研究者利用snRNA-seq对成年小鼠颈上神经节和星状神经节进行分析，并使用寡核苷酸标签（HTOs）追踪神经节来源，成功捕获神经元、卫星胶质细胞和内皮细胞核，为心脏交感神经节的单细胞研究提供了资源。作者同时指出，核RNA与胞质RNA之间的差异会影响对活动依赖性转录的解释，且跨物种和不同神经节间的重复性仍需验证。
Mechanisms of cardiac–neural interactions and disease relevance
这一部分从功能层面讨论单细胞研究如何揭示ICNS细胞多样性与神经-心脏通讯、疾病易感性之间的联系，显示ICNS并非单纯的神经中继，而是高度可塑的局部调控网络。
The cardiac–neural axis: from anatomical connectivity to molecular regulation
作者指出，现代单细胞及多组学技术正逐步揭示心脏-神经接口的分子基础。通过单细胞测序、谱系追踪和高级成像相结合，研究者已能够从胚胎发育起源到生理调控多个层面绘制心脏-神经轴。文中以DuTracer研究为例，说明第一心场与第二心场细胞起源可被区分，并鉴定Foxb1为引导神经-中胚层祖细胞向神经谱系分化的转录调控因子，从而把早期胚胎模式形成与心脏神经元命运决定直接联系起来。
Insights from model organisms: molecular and functional diversity
在模式动物研究中，文章重点讨论了成年斑马鱼ICNS的综合分析。研究者联合应用scRNA-seq、神经化学标记及电生理技术，发现HuC/D阳性神经元分布于心脏各区域，并解析出包含心肌细胞、神经元及支持性胶质细胞在内的22个细胞簇。该研究进一步表明，不同神经元放电特性与心率直接相关，心内神经元不同步的神经递质释放可扰乱心肌收缩。此外，具有自发去极化和超极化后反跳放电特征的“爆发型神经元”被认为与致心律失常活动有关。作者据此提出，心内神经元在分子与功能层面均具有显著异质性，不同亚群可能分别承担节律控制、信号整合或病理重塑任务。
文中还指出，除细胞亚型差异外，ICNS可能存在区域特异性的组织模式。例如右心房神经节丛与左心房神经节丛在解剖连接与电生理效应方面并不相同，尤其涉及窦房结活动与房室传导调节。现有单细胞数据在空间分辨率上仍有限，但未来与解剖定位和空间转录组学联合后，有望识别神经节特异性分子程序。
Cardiac nexus glia as critical modulators of neural–cardiac crosstalk
文章特别强调心脏枢纽胶质细胞（cardiac nexus glia，CNG）的发现是心脏神经生物学的重要进展。该类胶质细胞在斑马鱼、小鼠和人中均被鉴定到，并表达典型星形胶质细胞标志。scRNA-seq分析显示，CNG在分泌因子meteorin作用下经Jak/Stat3通路成熟。功能去除实验表明，CNG缺失可延迟或损害心脏轴突支配，尤其影响流出道区域，并增加室性心律失常易感性。由此可见，CNG不仅参与神经发育时序控制，还通过协调交感与副交感输入维持心律电生理稳态。
Neuro–immune–cardiac interactions in disease pathogenesis
在神经-免疫-心脏互作方面，文章综述了两类代表性研究。其一是在大脑中动脉闭塞模型中，缺血性卒中可通过单核细胞来源巨噬细胞扩增诱发继发性心脏损伤；单细胞RNA测序识别出表达CCL2并激活NLRP3炎性小体的心脏巨噬细胞亚群，它们驱动心肌炎症与功能障碍。其二是在射血分数保留型心力衰竭（heart failure with preserved ejection fraction，HFpEF）模型中，经皮迷走神经刺激（transcutaneous vagus nerve stimulation，tVNS）可通过重编程驻留巨噬细胞亚群改善心功能，表现为促炎性CCR2
+/Spp1阳性巨噬细胞减少，而修复性TLF
+/MHC-II
+/Igf1阳性亚群增加。上述结果表明，自主神经调控可通过免疫平衡重塑发挥心脏保护作用。
作者也谨慎指出，目前证据多停留于自主神经失衡与免疫激活之间的关联层面，尚未充分解析究竟是哪些特定神经元或胶质细胞亚型主导了这些双向调控过程。因此，未来仍需借助空间转录组学与功能扰动实验来明确细胞特异性机制。
Future directions and clinical translation
最后一部分围绕技术瓶颈、计算整合与临床转化展开。文章认为，单细胞测序已深刻改变ICNS研究格局，但其广泛应用仍受多重限制。首先，成人心脏组织致密且富含细胞外基质（extracellular matrix，ECM），酶消化和机械吹打易损伤脆弱的神经元与胶质细胞，并诱导即时早期基因和应激反应程序，造成解离伪影与细胞组成偏倚。snRNA-seq虽可改善脆弱细胞回收并适用于冷冻样本，但因主要捕获核内转录本，可能低估成熟胞质mRNA及快速神经信号相关转录本，因此未来应加强scRNA-seq与snRNA-seq的联合整合，或开发兼顾胞质保存与样本活性的混合方案。
其次，跨物种外推仍是重大难题。当前多数知识来自斑马鱼与小鼠，而它们在心脏结构、神经支配密度和再生能力方面与人类差异明显。尽管人类心脏单细胞和空间转录组图谱快速增长，但针对人类ICNS本身的高分辨率数据仍明显不足，原因包括组织获取困难、神经结构脆弱且解剖分散。现有人类数据多来自心耳、心室、外科切除样本、供体心脏或终末期心衰标本，神经元与胶质细胞通常丰度较低、解析不完整，因此转化解释多仍处于假说生成阶段。文章提出，大动物研究以及人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cell，hiPSC）来源心脏-神经共培养体系和三维心脏类器官，可能成为连接实验系统与人类病理生理的重要桥梁。
在计算层面，多模态大规模数据的整合是另一核心挑战。scRNA-seq、snRNA-seq与空间转录组数据通常具有高维、稀疏和噪声特征，传统聚类和降维方法可能将连续的生物学状态过度离散化。为解决这一问题，人工智能（artificial intelligence，AI）与机器学习（machine learning，ML）正被引入单细胞分析流程，包括图神经网络、生成模型、多模态整合框架、轨迹推断算法及细胞-细胞通讯分析。这些方法有助于重建神经元、胶质细胞、免疫细胞与基质细胞之间的相互作用网络，并与电生理信息整合以刻画区域特异性神经-心脏网络。尽管如此，作者强调，计算定义的细胞簇和轨迹并不必然等同于稳定的生物学实体，仍需电生理、谱系追踪、空间定位和功能扰动等正交证据验证。
临床转化方面，文章列举了若干启示性案例，说明高分辨率转录图谱有助于发现治疗靶点并指导精确干预。基于ICNS研究，未来两条主要转化路径包括：利用细胞类型特异性表达信息发展基因靶向治疗，以精确调控致心律失常神经元或胶质调节因子；以及基于单细胞特征进行生物标志物开发，以实现自主神经功能障碍的早期识别和风险分层。作者提出，较为合理的转化流程应包括疾病相关细胞状态识别、候选靶点优先排序、多模态验证、靶向干预开发以及患者分层应用等步骤。
Concluding remarks
结语部分指出，单细胞测序已经重塑了心脏神经生物学的概念框架。通过在细胞和分子层面解析ICNS，研究人员得以重新认识心脏神经元与胶质细胞的发育起源、谱系关系及功能多样性，从而证明心脏内部的“小脑”并非被动传递自主神经指令，而是一个主动且适应性的调控网络。随着转录组学、空间信息与功能数据的进一步整合，未来研究将从单纯描绘细胞类型走向实时解码动态神经-心脏互作，最终服务于通过修复或重编程神经回路恢复心脏稳态的治疗创新，并推动神经-心脏精准医学的发展。
