单细胞核转录组学鉴定少突胶质前体细胞(OPC)向胶质瘤进展过程中细胞周期与突触通路失调

《Frontiers in Cellular Neuroscience》：Single-nucleus transcriptomics identifies cell cycle and synaptic pathway dysregulation during OPC-to-glioma progression

　　

胶质瘤以生存率低、治疗选择有限为特征。基于少突胶质前体细胞(oligodendrocyte progenitor cell, OPC)转录本转录富集现象，proneural型胶质瘤被认为起源于OPC的转化。本研究将携带Trp53缺失及PDGF-BB过表达（BB-p53nOPC）的突变OPC注射入受体小鼠，对注射后早期及晚期（与MRI检出肿瘤团块时间点吻合）的注射细胞及脑组织对单细胞核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing, snRNA-seq）。分析荷瘤脑样本发现一在正常脑中未检出的细胞群，富集OPC标志物（Olig2）、细胞周期基因（Myc）及胶质瘤标志物（Top2a, Sox2），研究人员将其命名为"OPC-like"群。具"OPC-like"特征的人群亦具更高推断拷贝数变异（inferred copy number variations, inferCNV）基因组分布及高增殖率，故被判定为"肿瘤"细胞。晚期样本inferCNV基因组负荷高于早期样本，提示进行性基因组不稳定性。免疫组化验证了"OPC-like"标志物TOP2A与SOX2的高增殖率及广泛表达。对周期细胞拟时序（pseudotime）分析识别出从早期至晚期细胞周期检查点调控递减、突触信号递增的轨迹。综上，早期时间点特征为出现具独特"OPC-like"转录特征与inferCNV的高增殖细胞群；晚期特征为inferCNV进一步基因组扩散、细胞周期检查点丢失及符合神经元–胶质瘤互作增强的突触信号转录改变。

研究背景与目的

胶质瘤是最常见且致死率最高的原发性脑肿瘤，被认为起源于中枢神经系统胶质细胞，其中proneural型胶质瘤推测起源于少突胶质前体细胞(oligodendrocyte progenitor cell, OPC)。尽管手术、放疗和化疗有所进展，高级别胶质瘤预后仍差，治疗手段有限。前期研究发现携带Trp53缺失并过表达PDGF-BB（BB-p53ⁿOPC）的突变OPC注射入同系小鼠可形成胶质瘤，而仅Trp53缺失的OPC不能成瘤，但注射后随时间推移从早期到晚期胶质瘤形成的转录动态变化尚未阐明。研究人员采用纵向单细胞核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing, snRNA-seq）设计，对注射BB-p53ⁿOPC后早期（MRI检出小肿瘤团块，约45天 post-injection, dpi）和晚期（MRI检出大肿瘤伴临床症状，60–73 dpi）荷瘤脑组织和培养BB-p53ⁿOPC细胞核进行snRNA-seq，旨在鉴定OPC向胶质瘤进展过程中的关键分子与细胞事件。研究发现早期出现具独特"OPC-like"转录特征、推断拷贝数变异（inferred copy number variation, inferCNV）及高增殖的细胞群即肿瘤起始群；晚期肿瘤表现为inferCNV基因组范围扩大、细胞周期检查点丢失及突触信号通路上调，提示神经元–胶质瘤互作参与后期进展。该成果发表于《Frontiers in Cellular Neuroscience》。

主要关键技术方法

研究人员分离 postnatal第5–7天Trp53^fl/flC57BL/6小鼠脑原代OPC，以PDGFB-IRES-CRE逆转录病毒感染构建Trp53缺失并PDGF-BB过表达（BB-p53ⁿ）OPC；将5×10⁴BB-p53ⁿOPC立体定向注射入同系雌性C57BL/6J小鼠皮质下白质，于早期（45 dpi，n=3）和晚期（60–73 dpi，n=3）采集含肿瘤及正常脑组织的组织块。冻存组织经改良10X Genomics细胞核分离试剂盒提取细胞核，进行10X Chromium 3′ Gene Expression建库并Novaseq 6000测序；同期处理培养BB-p53ⁿOPC细胞核作对照。原始数据经Cell Ranger(v8.0.1)比对mm39参考基因组并过滤，利用Seurat(v5.1.0)进行归一化、降维、无监督聚类及RPCA整合批次校正；Azimuth自动注释联合模块评分（module scoring）手动注释"OPC-like"群；以10X正常小鼠脑snRNA-seq为参照用inferCNV(v3.20)包推算CNV负荷；采用TRICYCLE评估肿瘤细胞周期相位；以monocle3对周期肿瘤细胞计算拟时序（pseudotime）；差异表达分析用edgeR伪 bulk法，基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）用clusterProfiler；免疫组化验证TOP2A与SOX2蛋白表达。

研究结果

Single-nucleus RNA-seq of mutant BB-p53ⁿOPCs identifies a population of progenitor cells resembling the primitive OPC phenotype

培养BB-p53ⁿOPC的snRNA-seq显示其为异质性群体（5个亚群），均表达少突胶质谱系转录因子Olig1、Olig2及部分Sox2，个别亚群表达Plp1或低Pdgfra/Cspg4，不富集神经元、星形胶质细胞或神经祖细胞标志物。Bulk RNA-seq验证富集OPC及primitive OPC特征基因，无显著Neftel NPC-1/NPC-2特征。免疫细胞荧光证实PDGFRα⁺/OLIG2⁺纯度高。表明注射用突变OPC具primitive OPC表型转录特征，与胶质瘤发生相关。

Single nucleus RNA-seq of brain samples from mice with early- and late-stage gliomas reveals the emergence of an expanding population of OPC-like cells characterized by the expression of glioma markers

早期及晚期荷瘤脑组织与正常脑整合聚类中，早期及晚期样本出现正常脑不存在、Azimuth无法归类的"unclassified"群，高表达Olig2、Sox2、Tubb3、Top2a及Myc，被命名为"OPC-like"。伪 bulk差异分析示其上调细胞分裂基因（Myc、Cdk1、Top2a）下调突触信号基因（Shank1、Camk1、Pvalb）；GSEA示富集细胞分裂、血管发育及胶质发生，突触传递相关条目下调。早期样本含丰富宿主脑细胞类型，晚期样本OPC-like群显著扩增且正常脑细胞类型稀疏，符合大体及组织学所见肿瘤破坏。

Identification of tumor cell clusters

将早/晚期荷瘤数据与正常脑数据整合后发现同时富集"OPC-like"特征及Neftel OPC胶质母细胞瘤(glioblastoma, GBM)特征和NPC GBM特征的群，且这些群高表达Top2a、Myc等胶质瘤标志物，被定义为肿瘤群。inferCNV分析示早期肿瘤染色体1、7、8、15、16扩增及7、11、17、19缺失，晚期CNV波及范围更广；计算全基因组CNV评分（infer CNV score）显示最高值即肿瘤群。证实OPC-like群即胶质瘤细胞。

Tumor cells from late-stage gliomas are enriched in genes involved in cell cycle, and gliogenesis

早、晚期肿瘤群差异表达及GSEA示晚期富集细胞周期正调控（positive regulation of cell cycle）条目。TRICYCLE细胞周期相位分析示早期肿瘤多数细胞停滞于G1/G0期、<10%处于S-G2/M期，保留G1限制点；晚期各周期时相细胞比例趋近均等，提示细胞周期检查点失控，伴随Mki67与Myc表达升高。Top2a在早期小肿瘤群低表达、晚期大肿瘤群几乎全表达，免疫组化及培养细胞验证TOP2A蛋白在晚期肿瘤及培养胶质瘤细胞中升高。胶质发生相关基因Cd44、Sox2、Nfia晚期表达高于早期，SOX2免疫组化及培养细胞荧光验证一致。表明进展中肿瘤增殖增强并保留primitive OPC特征。

Pseudo-time analysis on cycling tumor cells reveals a transcriptional evolution characterized by alterations in genes involved in cell cycle control and glutamate receptor signaling

对经TRICYCLE筛选的S/G2/M期周期肿瘤细胞用monocle3拟时序分析并以OPC-like特征群为根，晚期周期细胞占拟时序后端。沿拟时序细胞周期检查点调控（GO:0000075）评分降低，突触组装（GO:0007215）评分升高。Pearson相关分析示Lrrtm4、Syt1、Cntnap2、Gria1、Gabrg3、Gabrb2、Gabrb3等突触传递基因表达随拟时序正相关上调。突触传递基因在正常早期脑主要见于神经元，晚期在肿瘤群富集，支持肿瘤进展中神经元–胶质瘤突触互作增强的转录证据。

讨论与结论

研究人员讨论指出BB-p53ⁿOPC为具Primitive OPC特征（Sox2⁺、Nfia⁺、低Tubb3）的异质群体，注射后早期即出现正常脑不存在、具OPC及胶质瘤标志物并高表达细胞周期基因的OPC-like肿瘤群，伴局限inferCNV；晚期该群大幅扩增，inferCNV基因组分布更广，细胞周期检查点丢失，突触传递（含谷氨酸能AMPA受体亚基Gria1及GABA能受体亚基Gabrb3等）基因上调，与文献报道神经元–胶质瘤突触互促增殖相符。推断CNV广布及检查点失效驱动晚期扩增，神经元–胶质瘤突触信号可能促进后期生长。结论如下：本研究通过注射突变OPC诱导胶质瘤模型的纵向snRNA-seq分析表明，胶质瘤发生早期出现源自注入突变OPC、具Primitive OPC基因表达及"OPC-like"特征的高增殖细胞群，其具inferCNV；肿瘤进展至晚期伴随基因组不稳定性增加、细胞周期检查点丢失及突触信号转录特征增强——提示神经元–胶质瘤互作参与晚期进展，为靶向Primitive OPC特征及突触通路的干预策略提供线索。