《Journal of Neuroinflammation》：N-Acetylcysteine protects the developing brain in neonatal sepsis-like inflammation via a redox–neurovascular pathway
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背景：新生儿脓毒症可通过氧化应激、血脑屏障（BBB）功能障碍、外周白细胞浸润和白质损伤破坏大脑发育。N-乙酰半胱氨酸（NAC）是一种具有抗氧化和免疫调节特性的谷胱甘肽前体，是一种有前景的神经保护候选药物，但其在新生儿脓毒症样脑损伤中的作用尚未完全明确。本研究旨
背景：新生儿脓毒症可通过氧化应激、血脑屏障（BBB）功能障碍、外周白细胞浸润和白质损伤破坏大脑发育。N-乙酰半胱氨酸（NAC）是一种具有抗氧化和免疫调节特性的谷胱甘肽前体，是一种有前景的神经保护候选药物，但其在新生儿脓毒症样脑损伤中的作用尚未完全明确。本研究旨在探讨早期NAC预处理及后续持续治疗是否与新生儿脂多糖（LPS）模型中的保护作用相关，并检查与其效应相关的主要机制。
方法：在本研究中，新生C57BL/6J小鼠在出生后第3天（PND3）接受脂多糖（LPS；3 mg/kg，皮下注射）以模拟脓毒症样损伤。NAC在LPS前2小时腹腔注射（200 mg/kg），随后从PND4到PND14每日给药（100 mg/kg/天）。存活率监测至PND21。PND4的急性结局包括氧化应激、胶质细胞/炎症标志物、髓过氧化物酶（MPO）阳性细胞积累、细胞凋亡和BBB相关损伤。长期结局包括髓鞘形成、齿状回增殖和行为。
结果：NAC改善了新生期LPS暴露后的存活率，探索性性别分层分析表明雄性获益更大。NAC部分恢复了皮层谷胱甘肽水平并减少了脂质过氧化，表明氧化还原平衡得到改善。尽管在所检查的时间点，NAC未显著改变半乳糖凝集素-3（galectin-3）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）或核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族pyrin结构域包含蛋白3（NLRP3）的表达，但它减少了皮层MPO阳性细胞负荷，并减弱了与神经血管损伤和BBB相关病理相关的标志物，包括基质金属肽酶-9（MMP-9）表达和白蛋白外渗。NAC还降低了选定脑区的细胞凋亡，并部分改善了白质相关结局，包括少突胶质细胞前体细胞丰度、髓鞘形成和早期感觉运动表现。然而，在PND60时，旷场实验和新物体识别测试中的长期行为表现未得到显著改善。
结论：总体而言，早期NAC预处理及后续持续治疗减轻了新生期LPS诱导的脓毒症样脑损伤并提高了存活率，其保护作用与氧化还原稳态的恢复、MPO阳性白细胞减少以及神经血管损伤和BBB相关病理标志物减弱相关，而非广泛抑制所测得的炎症介质。这些发现与NAC相关神经保护中氧化还原-神经血管-白细胞通路的潜在作用一致，并支持在面向预防的高风险早产人群相关实验范式中进一步评估NAC。
本研究发表于《Journal of Neuroinflammation》，旨在探索N-乙酰半胱氨酸（NAC）在新生期脓毒症样炎症模型中保护发育大脑的潜力与机制。全球每年约有1340万早产儿出生，他们感染风险增高，是易感人群。新生儿脓毒症是死亡和长期神经发育障碍的主要原因，尤其在早产儿中。除急性全身不稳定外，生命早期感染可破坏大脑成熟的关键阶段，增加白质损伤、运动障碍和后期认知缺陷的风险。发育中的大脑在相当于早产的时期尤为脆弱，此时少突胶质前体细胞占主导，且对炎症和氧化损伤高度敏感。尽管小胶质细胞活化和细胞因子信号传导是围产期脑损伤的已知因素，但氧化应激、血脑屏障（BBB）功能障碍和外周免疫细胞募集在未成熟大脑的炎症相关损伤中日益被认为是关键驱动因素。因此，亟需确定能够减轻易感早产儿感染相关脑损伤的神经保护策略。
研究人员采用系统性脂多糖（LPS）暴露作为新生期脓毒症样炎症的广泛使用模型，因其再现了感染相关脑损伤的多个特征，包括BBB破坏、胶质细胞和血管活化以及白质发育受损。在新生啮齿动物中，出生后最初几天暴露特别具有参考价值，因为此发育阶段大致对应脆弱的人类早产大脑。该模型为研究系统性炎症如何影响发育中大脑的氧化还原稳态、神经血管完整性、免疫细胞运输和区域特异性损伤提供了机会。NAC是谷胱甘肽前体，具有抗氧化和免疫omodulatory特性，并有文献记载其中枢神经系统生物利用度。由于未成熟大脑的抗氧化防御有限，NAC是新生儿神经保护的有吸引力的候选药物，尤其在氧化应激显著的情况下。先前研究表明，NAC可减轻炎症致敏的脑损伤，保护少突胶质细胞谱系细胞，并改善围产期模型中的髓鞘形成。NAC还被报道可抑制中性粒细胞向发育中大脑的迁移，提示其保护作用可能不仅涉及氧化还原调节，还涉及脑-免疫界面的调控。然而，其在出生后新生期脓毒症样脑损伤中的作用仍未完全明确，特别是关于中性粒细胞相关损伤、BBB功能障碍、区域脆弱性以及早期机制效应与后期结构和功能结局之间的关系。
在本研究中，研究人员采用新生小鼠LPS诱导的脓毒症样脑损伤模型，以确定早期NAC预处理及后续持续治疗是否提高存活率并减轻脑损伤。他们特别检查了NAC相关保护是否与氧化还原平衡恢复、白细胞相关脑浸润减少以及神经血管功能障碍标志物减弱相关，以及这些效应是否伴随白质相关和神经行为结局的改善。通过在LPS暴露前给予NAC并在此后维持治疗，研究人员采用了面向预防的概念验证设计，以确定早期氧化还原稳态调节是否能增强发育中大脑对后续炎症损伤的抵抗力。该方法使研究人员能够描述NAC的神经保护特征，特别关注氧化还原-神经血管-白细胞损伤轴。
研究主要关键技术方法包括：使用新生C57BL/6J小鼠建立LPS诱导的脓毒症样炎症模型；实验设计分为对照组、NAC组、LPS组和NAC+LPS组；NAC在LPS前2小时以200 mg/kg腹腔注射作为负荷剂量，随后从PND4至PND14每日给予100 mg/kg维持剂量；存活率和体重监测至PND21；在PND4和PND21时间点收集脑组织进行组织学和分子分析，包括免疫组织化学检测髓鞘碱性蛋白（MBP）、裂解半胱天冬酶-3（cleaved caspase-3）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、半乳糖凝集素-3（galectin-3）、血小板衍生生长因子受体-α（PDGFR-α）、髓过氧化物酶（MPO）、Ki-67和双皮质素（DCX）；免疫印迹分析裂解半胱天冬酶-3、基质金属肽酶-9（MMP-9）、白蛋白、NLRP3、超氧化物歧化酶2（SOD2）、过氧化氢酶（catalase）、闭合蛋白-5（claudin-5）和β-肌动蛋白（β-actin）的表达；通过商业试剂盒测定皮层谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）和3-硝基酪氨酸（3-NT）水平以评估氧化还原状态；在PND8进行负趋地性测试和平面翻正反射测试评估早期感觉运动功能，在PND60进行旷场实验和新物体识别测试评估长期行为；统计分析采用Kaplan-Meier曲线和log-rank检验分析存活率，线性混合效应模型分析体重轨迹，双因素方差分析（ANOVA）评估组别和性别效应及其交互作用，后续进行适当的事后检验。
研究结果部分，各小标题下的主要结论如下：
**NAC提高新生期LPS挑战后的存活率，但仅适度改善出生后生长**：LPS暴露导致显著死亡率和出生后生长受损。NAC治疗将LPS暴露动物的存活率从50.8%提高至66.7%，表明保护作用。探索性性别特异性分析提示此生存获益主要见于雄性。LPS还导致持续的生长限制，NAC治疗适度减轻了这种生长障碍，但效果有限。
**NAC改善新生期LPS暴露后的皮层氧化还原状态，但不改变抗氧化酶表达**：LPS挑战破坏了皮层氧化还原平衡，表现为谷胱甘肽水平降低和丙二醛水平升高。NAC治疗显著增加了谷胱甘肽并降低了丙二醛至接近对照值，表明脂质过氧化减弱。3-硝基酪氨酸水平无显著差异。免疫印迹分析显示SOD2和过氧化氢酶水平在各实验组间无显著差异。
**NAC对新生期LPS挑战后的早期胶质细胞活化或皮层NLRP3表达影响甚微**：LPS在多个脑区触发了半乳糖凝集素-3阳性细胞的显著增加，但NAC治疗未显著降低任何分析区域的半乳糖凝集素-3阳性细胞数量。GFAP阳性细胞计数的变化模式类似，LPS显著增加，而NAC未显著改变此反应。皮层NLRP3蛋白表达在LPS后增加，NAC未显著降低其水平。
**NAC限制皮层白细胞积累并减少新生期LPS挑战后BBB破坏的标志物**：LPS显著增加了多个脑区的MPO阳性细胞积累。NAC显著降低了皮层MPO阳性细胞数量，但在其他检查区域未产生显著效应。皮层免疫印迹分析显示，LPS增加了MMP-9表达和白蛋白外渗。在探索性性别分层分析中，NAC降低了雄性的MMP-9和白蛋白水平，但在雌性中这些效应不明显。闭合蛋白-5表达在此时点未受LPS或NAC显著改变。
**NAC减弱LPS诱导的凋亡损伤，在探索性雄性分析中效应更强**：LPS增加了皮层、皮层下白质和海马角（CA）的凋亡细胞计数。NAC治疗显著降低了皮层、皮层下白质和CA的裂解半胱天冬酶-3阳性细胞数量。考虑性别时，在皮层和CA检测到显著的组别-性别交互作用，探索性性别分层分析表明NAC在皮层和CA的抗凋亡效应主要在雄性中明显。皮层蛋白分析支持了这些组织学发现。
**NAC对新生期LPS暴露后的少突胶质细胞相关和白质相关结局提供部分保护**：LPS减少了皮层血小板衍生生长因子受体-α（PDGFR-α）阳性少突胶质前体细胞数量，而NAC显著增加了这些计数。在皮层下白质，PDGFR-α阳性细胞数量变化较不明显，NAC未产生显著效应。在PND21，LPS减少了皮层下白质的MBP阳性体积，NAC部分恢复了此指标。新生皮层面积在各组间无显著差异。LPS显著减少了齿状回Ki-67阳性增殖细胞数量，而NAC恢复了增殖水平。双皮质素免疫反应性在各组间无差异。
**NAC改善早期趋地性表现，但不影响其他检查的行为指标**：LPS暴露损害了负趋地性任务的表现，NAC治疗改善了此缺陷。平面翻正反射表现各组相似。在PND60，旷场实验中的运动活动或焦虑相关探索行为以及新物体识别任务中的识别记忆表现均未检测到组间差异。
讨论部分总结如下：本研究确定早期NAC预处理及后续持续治疗是新生期LPS诱导脓毒症样脑损伤中部分有效的神经保护干预措施。NAC提高了存活率，恢复了皮层氧化还原平衡的关键方面，减少了皮层MPO阳性细胞积累，并减弱了与神经血管损伤相关的标志物，同时伴随细胞凋亡减少和白质相关结局的部分保留。相比之下，NAC在24小时未显著降低半乳糖凝集素-3、GFAP或NLRP3，也未改善此处所用行为测试的长期表现。总体而言，这些发现与NAC相关神经保护通过氧化还原-神经血管-白细胞机制而非广泛抑制所测胶质炎症反应的作用一致。氧化还原数据支持谷胱甘肽恢复是保护的核心机制。第二个关键发现是NAC减弱了LPS诱导的与神经血管和白细胞相关损伤相关的分子变化。值得注意的是，尽管改善了氧化还原平衡和神经血管相关结局，NAC在24小时未显著改变半乳糖凝集素-3阳性细胞、GFAP阳性细胞或皮层NLRP3表达。这种明显的分离可能反映了新生儿神经炎症的时间性和区室特异性。白质数据强化了此保护特征的生物学相关性。功能上，NAC改善了PND8的负趋地性，但未改变平面翻正反射、旷场行为或新物体识别。这种模式表明早期生化和组织学保护转化为适度的短期感觉运动获益，但不足以在此处使用的后期行为测试组合中产生可检测的效应。探索性分析提示存活率和选定的BBB及凋亡相关结局可能存在雄性偏向的获益。尽管这些信号并不一致且应谨慎解释，但它们与证据一致，即雄性和雌性新生儿大脑在炎症信号传导、氧化应激处理和细胞死亡通路上存在差异。本研究存在若干局限性，包括LPS模型捕捉了内毒素驱动的炎症但未能完全复现临床新生儿脓毒症的复杂性；NAC在LPS暴露前给予并持续，因此该研究应被视为面向预防的概念验证范式而非已确立脓毒症的治疗模型；机制分析有限；长期解释受早期显著死亡率和使用相对狭窄的行为测试组合的限制。
结论部分翻译如下：在此新生小鼠LPS诱导脓毒症样脑损伤模型中，早期NAC预处理及后续持续治疗提高了存活率并提供部分神经保护。此保护主要与氧化还原平衡恢复、MPO阳性白细胞积累减少以及神经血管损伤相关标志物减弱相关，而所检查的胶质炎症标志物在评估时间点未受显著影响。总之，这些发现表明涉及氧化还原失衡、神经血管损伤和白细胞相关反应的相互作用可能有助于观察到的NAC神经保护效应。本研究结果为在高风险早产新生儿人群中进一步评估NAC作为预防性神经保护策略提供了依据。
