缺氧状态下CA9高表达的间质样胶质瘤干细胞会促进复发性胶质母细胞瘤中依赖ANXA1-FPR1的巨噬细胞极化现象

《Journal of Neuroinflammation》：Hypoxic CA9-high mesenchymal-like glioma stem cells promote ANXA1-FPR1-dependent macrophage polarization in recurrent glioblastoma

　　

摘要

背景

复发性胶质母细胞瘤的特点是明显的髓系重塑以及极度免疫抑制的微环境。尽管碳酸酐酶9是一种与侵袭性胶质母细胞瘤行为相关的典型缺氧诱导分子，但其在复发性胶质母细胞瘤中的细胞类型特异性分布及其在胶质瘤干细胞与巨噬细胞相互作用中的作用仍不完全清楚。

方法

我们整合了公共转录组数据、单细胞RNA测序、定量蛋白质组学、配对临床样本以及体外/体内功能实验，以明确CA9在复发性胶质母细胞瘤中的作用。我们能够以单细胞分辨率区分恶性细胞状态和肿瘤相关巨噬细胞亚群，并通过计算方法推断细胞间通讯。我们在胶质母细胞瘤细胞系和患者来源的胶质瘤干细胞中建立了CA9功能获得和丧失模型。通过qRT-PCR、西方印迹、ELISA以及启动子报告基因检测方法来评估ANXA1的表达和分泌情况。此外，还通过条件培养基转移、重组ANXA1 rescue实验以及环孢素H介导的FPR1阻断实验来检测巨噬细胞的极化状态。

结果

在胶质母细胞瘤中CA9表达升高，在间质性和复发性肿瘤中更为丰富，且与较差的生存预后相关。单细胞分析显示CA9主要存在于与缺氧相关的MES样胶质瘤干细胞亚群中，这类细胞在复发性肿瘤中数量增加且干性特征更强。复发性肿瘤中还存在更多SPP1阳性、具有免疫抑制功能的肿瘤相关巨噬细胞。蛋白质组学、转录组学以及细胞间通讯分析表明ANXA1是CA9调控下的下游介质，具有分泌型免疫调节作用。缺氧会同时诱导CA9和ANXA1的表达，而缺氧反应元件突变则会减弱ANXA1启动子的激活。去除CA9会降低ANXA1的表达和分泌，抑制胶质母细胞瘤的生长表现，同时减弱缺氧对ANXA1表达的诱导作用。CellChat分析显示，在复发性胶质母细胞瘤中，缺氧状态的MES样胶质瘤干细胞与SPP1阳性肿瘤相关巨噬细胞之间的信号传导增强，其中ANXA1-FPR1通路是主要的信号传递轴。功能实验表明，高CA9表达的胶质母细胞瘤细胞产生的条件培养基会促进M2型巨噬细胞极化，而CA9敲低会削弱这种极化作用，重组ANXA1可部分恢复该效应，FPR1抑制剂则能显著抑制这一过程，这进一步证实了ANXA1作为辅助性旁分泌介质的作用。在体内实验中，去除CA9或在CA9表达正常的肿瘤中阻断FPR1都会减少与M2型巨噬细胞相关的信号通路。

结论

在复发性胶质母细胞瘤中，CA9在缺氧状态的MES样胶质瘤干细胞中含量较高，它通过依赖ANXA1的旁分泌途径促进免疫抑制性巨噬细胞极化。这些研究揭示了CA9-ANXA1-FPR1相关的神经免疫相互作用轴，该轴将缺氧状态下的干细胞样肿瘤特征与复发性胶质母细胞瘤的髓系重塑联系起来，其中ANXA1更多是作为辅助性旁分泌介质，而非CA9驱动免疫抑制作用的唯一效应因子。

图形摘要

在复发性胶质母细胞瘤中，CA9主要存在于与缺氧相关的MES样胶质瘤干细胞中。缺氧条件下CA9水平升高会促进ANXA1的表达和分泌。分泌出的ANXA1会与SPP1阳性肿瘤相关巨噬细胞中的FPR1相关信号通路发生相互作用，从而促使巨噬细胞呈现M2型免疫抑制表型。这种肿瘤向髓系的旁分泌信号通路会推动神经免疫系统的重塑，进而促进复发性胶质母细胞瘤的进展。