综述：蜜蜂（*Apis mellifera*）研究中的冷麻醉：风险与报告缺失

《Apidologie》：Cold anesthesia in honey bee (Apis mellifera) research: risks and reporting gaps

　　

在蜜蜂研究中，冷麻醉常被视为二氧化碳的安全替代方法。然而，文献中的证据表明这一假设仅部分成立。早期研究证实冷处理会影响蜜蜂的储粮行为和学习能力，而近期研究则报道其对神经调节物质（neuromodulators）、记忆巩固及运动能力产生作用。尽管这些效应通常不致命，但会以影响实验结果的方式改变生理和行为。尽管已有呼吁要求提高方法透明度，冷却方案的报告仍不一致。对历史与近期文献的回顾显示，虽然冷麻醉近乎普遍使用，但已发表的方法中经常遗漏持续时间、温度和处理细节，阻碍了重复并复杂解释。部分研究指出蜜蜂在冷却后一小时内即可恢复，但昆虫生理学研究强调存在神经或肌肉损伤的风险。综合来看，这些发现提示麻醉处理可能是当代蜜蜂认知与行为研究中一个被低估的变异来源。

1 引言
诱导麻醉的麻醉方法是蜜蜂（*Apis mellifera* L.）神经行为学研究的重要组成部分。它们常用于操持蜜蜂或处理其他因运动而棘手的情况。历史上CO₂为标准方法，但二十世纪中期的研究显示它会改变行为与生理，包括增加早熟花粉觅食、降低觅食效能、缩短寿命、促使蜂王提前产卵以及干扰昼夜节律。1980年，冷却被提议作为替代CO₂的更安全方法，并很快作为一种简单、低成本手段被采纳。尽管使用普遍，冷却在各研究间仍缺乏标准化。方法差异显著（冰、冰箱、冷冻柜；不同持续时间和条件），安全性通常仅凭死亡率判断，从而忽视了可能影响生理或行为结果（如学习、运动或神经调节物质表达）的神经系统或其他组织细微损伤的可能性。此外，方案报告不一致且常不完整，限制了重复和解读。
冷却相关风险数十年前便已被认知，并在近期研究中偶有提及。然而，研究人员仍继续使用不统一的方法且报告有限。解决的呼吁多次提出，但尚未促成实践中协调一致。蜜蜂脑与行为研究正取得迅速进展。随着该研究加速，重新审视这一常用技术至关重要。若不了解其影响，新发现可能无法充分反映蜜蜂的自然生理或行为状态，导致研究间比较复杂化及结果误读的可能。本综述总结了冷却麻醉对生理和行为影响的证据，评估了各研究间报告的一致性，并指出了仍需解决的关键研究空白，以在蜜蜂研究中制定安全、标准化的方案。

2 冷僵机制
冷却通过可兴奋细胞中的离子级联干扰诱发冷僵，从而中止神经和肌肉活动。这种细胞停摆可能带来超固定化的后果，包括记忆巩固和其他认知过程的中断。本节将总结蜜蜂中涉及的细胞生理学及观察到的认知效应。

2.1 细胞与生理机制
冷却作为变温无脊椎动物的有效麻醉方法。将昆虫浸入冰浴、置于冷板上或放入冰箱或冷冻柜可使其体内温度降至固定不动的点——冷僵，而不必造成组织损伤——冷伤。冷僵并非源于组织损伤，而是低温下细胞间信号传导中断。在冷僵形成时进行的肌肉活动电生理记录显示，出现一阵突然持续的爆发动作电位，其幅度逐渐减小直至细胞无法再发放。该模式在无脊椎动物中一致出现，尽管爆发持续时间和冷僵起始温度因物种而异；对蜜蜂而言，冷僵发生在10.6±1.2℃。
降温过程中主动运输的中断引发的高血钾症（hyperkalemia）似乎抑制了初始爆发后的动作电位，从而维持麻醉状态。实质上，去极化持续进行，直至膜两侧离子平衡达到，导致胞外K⁺升高，阻碍了进一步恢复。虽然这种信号中断不会立即导致损伤，但长时间或过度冷却会扰乱生理过程，若无缓解，最终导致细胞死亡，进而导致个体死亡。

2.2 认知机制：逆行性遗忘
由于冷却长期以来被用作探索记忆过程的工具，“遗忘”（amnesia）一词提供了有用的框架。在扩展到其他领域之前，“遗忘”一词于19世纪末首次被临床心理学家用来描述“事件”后失去或无法保留信息。从广义上讲，多种因素与生物功能中断均可导致此类遗忘，包括物理损伤和神经活动的简单中断。最初引起关注蜜蜂逆行性遗忘的研究旨在通过冷却中断记忆巩固，以评估短期记忆。在一项实验中，Erber (1976)给予蜜蜂探索蓝色和绿色发光饲喂盘的机会，仅其中一个含有蔗糖。随后标记蜜蜂，并分别施以冷却、CO₂、N₂或电击休克后释放。返回饲喂站时，处理组蜜蜂同等接近两种饲喂盘，而未经处理的对照组则强烈偏好之前与蔗糖配对过的颜色。该效应仅处理在初始探索后7min内实施时出现。若在7min后实施，各组表现则与对照组无异。
Erber等人(1980)使用约束蜂的经典条件反射测定拓展了该工作。气味与蔗糖奖励配对，并用冷却探针应用于特定脑区。冷却蘑菇体和嗅叶均以与全身冷却相同的程度干扰了预期性吻伸反应，提示全身冷却短暂地中断了这些脑区的活动。与早期研究一致，仅冷却发生在7min内时才见到效应，符合记忆巩固中断而非组织损伤。
这些实验共同表明，冷却可短暂中断记忆巩固而不造成持久组织损伤。基于此机制背景，接下来将考察冷却麻醉在蜜蜂研究中的应用，从其最早于20世纪80年代的使用开始。

3 蜜蜂冷麻醉研究
基于这些机制洞察，研究人员在多种实验情境下应用了冷麻醉。此处回顾其最早于20世纪80年代的应用，并追溯后续研究如何评估其效应与安全性。

3.1 早期应用（20世纪80年代）
冷却之被采用，乃因被认为比已发现具有有害影响的CO₂更安全。然而，早期研究表明冷却并非毫无潜在风险。80年代，蜜蜂通常在-20℃下冷却约3min。结果不一，未能提供安全性的明确证据。最为支持冷却方法的研究来自Ebadi等人(1980)，他们使用特制干冰室在野外将蜜蜂于-20℃冷却3min并与多种CO₂处理比较。捕获、固定、标记和释放蜜蜂后，评估其返巢能力、花粉觅食和死亡率，持续一周。未见对返巢能力、觅食行为或寿命有显著影响。
然而，其他研究则报告冷却麻醉对行为和生存具有影响。Mardan和Rinderer (1980)采用类似处理（-20℃ 3min；冷却类型和容器未报告），测试了蜜蜂的储粮行为——将蔗糖从小瓶移至笼中空巢脾区域。他们发现冷却显著降低储粮行为，指示行为受损。Robinson和Visscher (1984)随后在-20℃冰箱中冷却新出房蜂2min，死亡率达85%，显示日龄强烈影响耐寒性。综合而言，这些早期研究将冷却确立为CO₂的可能替代，但也凸显了行为代价、日龄依赖的死亡率以及有关其总体安全性的悬而未决问题。尽管在90年代冷却偶然被使用，但未发现该十年内评估其效应的系统性研究。

3.2 当代研究（2000年至今）
对冷却麻醉的研究关注于21世纪初恢复，以Pankiw和Page (2003)以及Chen等人(2008)为代表。Pankiw和Page (2003)发现，操控方法显著影响蔗糖反应性。操控后30min，统计分析表明，经CO₂或冷处理（在玻璃小瓶中5℃ 4min）麻醉的蜜蜂比未经麻醉的对照组更富反应性，尽管对照组30min时间的曲线看似左移，因而在高蔗糖浓度下更敏感。到60min时，所有组别均已趋同。作者将此模式解读为麻醉掩盖了未经麻醉蜂中明显的短暂操控应激。
Chen等人(2008)将蜜蜂在5℃冷却4min（记下1min时不动）以测试冷却对多巴胺（参与记忆提取）、章鱼胺（参与记忆巩固）和血清素（关联调节功能）水平的影响。结果显示，冷却显著降低了多巴胺和章鱼胺水平，而血清素未受影响。由于测定仅在冷却后立即进行，这些神经调节物质变化的持续时间仍不明确。
Chen等人(2014)进一步考察了冷却对联合嗅觉吻伸学习的影响。蜜蜂被置于锡纸上冰上冷却90s，导致约3min不活动，随后被训练学习将气味与蔗糖奖励关联。训练前30min冷却（获得）或训练后即刻冷却（巩固）显著削弱了绩效，而提取期间冷却无影响。这与早期工作一致，后者显示冷处理仅在训练后短时间内施加才会干扰记忆巩固。当Chen等人(2014)在训练前给予60min恢复期时，冷却组和未处理组间未见显著差异。同一研究中的运动分析亦显示，处理后15min活动降低，但30min时完全恢复。这些结果提示，在所述测试条件下，30至60min的恢复间隔对许多行为分析或许足够。
Frost等人(2011)试图测试多种冷却方法对蔗糖反应性的影响。然而，正如他们自己所指出，其实验设计将饱食与冷却后时间间隔混淆，导致结果难以解读。改进对照的重要验证将颇具价值。综合而言，2000年以来的研究显示冷却可影响反应性、神经调节物质水平、学习和运动，且恢复时间往往至关重要。不过，表面上行为恢复是否真正反映完全的生理恢复仍不确定——下一节将讨论此问题。

3.3 现行方法中的潜在损伤
虽然信息保留可能非首要关注，有关组织损伤和方法报告的问题依然存在。Tutun等人(2020)最近检验了各种冷却处理在不同时长下的效应，包括冷藏（4℃）和暴露于两种冷冻柜之一（-20℃和-80℃）。冰上冷却，另一种常用方法，未被测试。蜜蜂以20只群组置于笼中，按分配时长冷却，随后根据麻醉程度集体评分。记录完全恢复所需时间，并在室温2小时后评估死亡率。作者结论为-20℃ 3min是“安全的”，尽管有2.5%的死亡率。
虽然这一损失看似微小，但仅凭死亡率不足以完全评估安全性。幸存者仍可能经历组织损伤，如蝗虫中所示，其中冷却甚至在行为上看似恢复的个体中造成了神经与肌肉损伤。因此，仅凭死亡率或表面行为恢复本身可能无法排除这些处理下发生冷伤。此外，生理测定自身或许受冷却影响。Lin等人(2004)显示冷麻醉及相关操作应激可改变工蜂的保幼激素滴度。冷却对滴度的影响在不同蜂群间差异很大。某些蜂群中，护理蜂滴度在仅1小时冷却后便显著升高。然而，采集蜂滴度在8小时冷却后（一个蜂群）显著升高，在24小时冷却后（两个蜂群）显著下降，或在24小时冷却后（两个蜂群）保持不变。需留意冷却或操作可能引起的保幼激素滴度变化，此在行为成熟和分工研究中，保幼激素被广泛用作生理标记，而冷冻常作为常规固定方法使用。

4 当前冷却研究中的报告实践
除了已回顾的关键实验研究外，鲜有论文直接检验冷却方法报告的一致性。Frost等人(2011)十多年前提供了出色概述，但报告状况似乎此后改变不大。温度、时长、容器材料和冷却方法（冷冻柜、冰箱、冰等）的差异可能均影响结果，但这些细节常被遗漏。
为评估此问题之程度，我们在Scopus数据库中检索了2006–2010年与2020–2024年两个五年期内蜜蜂操控与麻醉研究，以屏蔽Frost等人(2011)呼吁提高透明度的时期。冷却在两个时期均是主要方法，但如何应用的报告不一致。许多研究未能说明容器类型、温度或时长，且通常使用如“在冰上冷却”之类的笼统措辞。总体上，方法论透明度在过去十年中几乎未见改进。

4.1 报告中的不一致
当提供细节时，它们在四个主要参数上并不一致。方法最常涉及冰或冰水浴，但许多论文未提供进一步信息，仅表述蜜蜂“被冷却”。像“在冰上固定”之类的措辞很常见，但含混不清：在某些情形下，可能指浸没在冰浴中，其他情况下则指将蜜蜂放在冰上。无明确说明则这些方法不易比较；温度及处理强度因此可能波动。冷却过程中容纳蜜蜂的容器类型也常被遗漏，偶尔注明玻璃，尽管塑料、金属及其他材料亦有报道。容器材料可能为重要细节：金属导热远快于塑料或玻璃，容器尺寸则会改变内部空气与冷却源达到热平衡的速度。两者均可能改变蜜蜂体温下降速率，但这些变量很少被记录。
温度是报告一致性最差的细节之一：多数情况下未给数值，给出时范围横跨-20℃到5℃。最后，时长变异极大，从几秒到10分钟，但常仅描述为“直至不动”，这一模糊终点使得跨研究比较困难。
此外，由于许多方法（如冰浴、冰箱、冷冻柜）要求将蜜蜂从处理中移出以检查状态，冷僵起始的确切点通常无法确认。这种不精确性使人难以知晓个体在移出前已被固定多长时间。总体而言，当作者指定明确的冷却时间范围并描述容纳蜜蜂所用材料时，报告最为可靠。然而，这些细节在大多数研究中缺失，限制了复现性与可比性。这些不一致性为评估报告是否随时间改善提供了重要背景。

4.2 时间段之间的比较
对比两个调查窗口揭示了报告方面的适度改善，但缺点持续存在。冷却在两个时期均为主要麻醉方法，但其文档记录在某些重要方面发生了变化。仅给出“冷却”之外无其他细节的研究比例从2006–2010年的26.7%降至2020–2024年的6.9%，而明确提及冰或冰水浴的比例则相应地从48.9%升至72.4%。时长报告亦发生明显变化。“直至不动”在早期最常见（42.9%），而近年骤降至13.2%。取而代之，3–5分钟的固定间隔愈发普遍，从仅4.8%升至30.2%的研究。这一转变表明对更一致描述需求的认识在提升，即便精确复现仍难以实现。
与方法与时长报告的适度改善相反，容器和温度细节则随时间变化甚微。两个时期均有超过半数研究未指定容器材料，当提及时，玻璃通常为默认，只有零星报告提及塑料、金属或其他材料。温度报告更为罕见，且极少提供的数值范围在-20℃到5℃之间。总体而言，这些类别在研究的参数中仍属报告最不连续的，数十年来未见明显进展。

5 结论
总体而言，尽管冷却在蜜蜂研究及许多无脊椎动物研究中是重要工具，但对当前神经行为学研究中使用的冷却方法范围进行系统评估的比较工作相对较少。现有研究表明冷却可影响储粮行为、神经调节物质水平（包括章鱼胺和多巴胺）、保幼激素滴度、学习获得与记忆巩固以及运动能力。尽管这些实验中有些报告冷却后1小时内明显恢复，但无一系统检验文献中现常用的全部方法范围。报告实践近年来看似有所改善，但重要空白依然存在，令再现性与解读复杂化。更清晰的报告将有助于跨研究比较，并助益确定观察到的效应反映的是实验操控还是麻醉操作本身。缺乏冷却条件的一致报告，便难以判断研究间差异反映的是生物学现象还是方法论变异。
替代麻醉剂已有所研究，如果蝇中的异氟醚（isoflurane）和七氟醚（sevoflurane）。在蜜蜂中，化学麻醉剂的使用大多限于评估麻醉效应的研究，而非作为神经行为学实验工具而采纳。异氟醚已被证明影响昼夜节律，并且相对于冷却和CO₂具有较低的代谢影响。然而，其对行为、寿命和神经调节物质的短期及长期效应尚未完全阐明。七氟醚在蜜蜂中仍有待测试。
未来针对文献中报道的冷却方法（跨越温度、时长和容器类型）进行直接比较研究，将改善对过去与未来研究的解读。在多个时间点和温度下测定对神经调节物质、运动活动、学习与记忆以及组织完整性的影响，将阐明冷却后恢复的动态过程。理解这些生物学效应对于解读现有结果至关重要，即便冷却作为麻醉方法最终被淘汰。麻醉效应亦应与操作应激本身一并考虑，后者在某些情境下对蔗糖反应性的影响已显示超过CO₂或冷却的影响。同样，仅将蜜蜂囚于笼中而不经冷却即抽取血淋巴，对保幼激素滴度的影响与冷却相似或更大。因此，在恰当应用时，麻醉仍是有用工具。挑战在于理解并减轻其效应，使研究人员能选择对其实验目标干扰最小的方法。更广泛地，将冷却本身视为一种实验因素而非中性的准备步骤，对于确保未来蜜蜂研究中可靠且具生理意义的结果至关重要。
鉴于上述考虑，若干实践步骤可提高未来研究的可靠性和可比性。至少，研究人员应清晰报告冷却条件，包括温度、时长、冷却方式（如冰、冷藏或冷冻暴露）及容器类型。冷却方案应在个体与试验间一致地选择和应用，并在研究内部标准化恢复期，以减少因操作带来的变异。在文献中，常用方法包括短时间冰上冷却和行为测试前的恢复期，尽管这些实践的影响仍未充分阐明。在条件允许时，对特定实验结局（如神经调节物质水平、学习绩效）的冷却方案进行初步验证，将有助于确定观察到的效应反应的是实验处理还是麻醉操作。当无法进行此类验证时，在解读结果时应承认这些潜在效应为变异来源。