基于拉曼光谱的先进葡萄糖控制策略用于优化哺乳动物细胞培养生产

《Biotechnology Progress》：Advanced glucose control strategies leveraging Raman spectroscopy for optimized mammalian cell culture manufacturing

　　

在哺乳动物细胞培养中维持生物治疗蛋白生产质量的一致性具有挑战性，非计划偏差会导致不一致性和潜在的批次失败。目前监测和控制关键工艺参数（CPP）的方法依赖于缓慢、劳动密集型的离线分析。这一问题在上游生产中尤为突出，不频繁的测量阻碍了CPP的实时监测，导致控制效果欠佳。该研究开发并实施了一个稳健、标准化的框架，将拉曼光谱（Raman spectroscopy）与实时机器学习（ML）模型及通过OPC-UA（Open Platform Communications Unified Architecture）控制的生物反应器相整合，实现了哺乳动物细胞培养CPP的无缝通信和有效控制。高精度的ML模型（R² > 0.92）实现了葡萄糖、乳酸、活细胞密度（VCD）和抗体滴度的实时监测。研究人员将葡萄糖模型集成到自动化过程分析技术（PAT）控制策略中，以将葡萄糖维持在预设设定点。该PAT策略与手动脉冲葡萄糖控制在高葡萄糖和低葡萄糖两种喂养方案下进行了比较。PAT控制方法使生物治疗产品滴度提高了高达35%，并将糖基化（glycation）降低了高达27%。这些结果表明，葡萄糖设定点和波动均会影响细胞培养性能。综上所述，该研究强调了PAT工具在自动化控制回路中的价值，从而提高了工艺性能，增强了生产率和质量。

该研究发表于《Biotechnology Progress》，旨在解决哺乳动物细胞培养生产生物治疗蛋白过程中质量控制的关键挑战。生物治疗蛋白作为治疗多种疾病和诊断用途的重要分子，其生产一致性受到蛋白质一级结构、宿主细胞系选择、克隆筛选以及跨单元操作制造工艺条件等多种因素影响。这种变异性会影响药物的药代动力学、安全性和有效性。在_upstream_manufacturing（上游制造）中，许多关键质量属性（CQA）受生物反应器内制造条件的影响，包括糖基化、聚集、片段化、电荷变异体和糖基化。葡萄糖浓度的剧烈波动会显著影响产品滴度和糖基化等质量属性。尽管监管机构已要求采用过程分析技术（PAT）改进过程监控，但当前大多数CPP仍依赖离线分析技术，存在耗时耗力、无法实现实时监测的局限。

该研究的核心创新在于构建了一个将拉曼光谱、实时机器学习模型与OPC-UA控制的生物反应器相整合的标准化框架，实现了PAT传感器、单板计算机（Raspberry Pi）和生物反应器控制系统三方的高效通信。研究人员开发了基于偏最小二乘回归（PLSR）的预测模型，对葡萄糖浓度、乳酸浓度、VCD和抗体滴度进行实时监测，模型精度R²均超过0.92。其中葡萄糖预测模型被集成到自动化PAT控制策略中，通过与手动脉冲葡萄糖控制的对比实验，验证了实时控制对提升细胞培养性能和产品质量的显著效果。

研究采用的关键技术方法包括：以中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）生产生物治疗蛋白的样本体系；7 L玻璃生物反应器（Applikon）的哺乳动物细胞培养平台，工作体积5 L，由DASware控制器（Eppendorf）控制；Kaiser RNX2拉曼光谱仪（Endress & Hausser）配备bIO-LAB浸入式探头，采用785 nm激光，光谱范围100–3425 cm^-1，曝光时间15 s，50次累加，每12.5 min完成一次采集；光谱预处理采用Python 3.8，包括多项式基线校正或非对称最小二乘基线校正、标准正态变量散射校正、Savitzky–Golay平滑滤波；PLSR模型构建与四折交叉验证优化；基于Nomikos方法的99%预测区间计算；Protein A高效液相色谱（HPLC）进行抗体滴度分析；以及通过肽-N-糖苷酶F（PNGase F）去糖基化后，采用Waters ACQUITY超高效液相色谱（UPLC）-电喷雾电离-轨道阱质谱（ESI-Orbitrap MS）进行糖基化分析。

模型开发与哺乳动物细胞培养监测

研究人员利用5个14天周期的哺乳动物细胞培养运行数据开发了PLSR预测模型。离线工艺参数每日早晚各记录一次，以扩大模型开发样本范围。拉曼光谱采集面临的主要挑战是荧光背景的干扰，尤其是营养密集补料中含有的芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）会产生显著荧光效应，随培养进程累积并掩盖拉曼信号。通过多项式或不对称最小二乘基线校正、标准正态变量散射校正以及Savitzky–Golay平滑的组合预处理，有效去除了荧光背景和随机噪声。

葡萄糖浓度模型训练集R²达0.976，测试集R²为0.955，RMSE分别为0.377 g/L和0.487 g/L，在高达10 g/L范围内保持高精度预测。乳酸浓度模型在0–18 g/L范围内表现优异，训练集和测试集RMSE分别为0.322 g/L和0.605 g/L。VCD模型可准确预测至45×10⁶ cells/mL，但在高浓度区域预测精度下降，主要源于样品稀释过程中误差放大效应。抗体滴度模型在高达7.5 g/L范围内，训练集和测试集RMSE分别为221.10 mg/L和362.09 mg/L。各模型误差水平与行业标准离线分析仪相当，具备替代离线技术的潜力。

反馈控制策略工作流程

研究设计并比较了两种反馈控制策略。手动控制策略依赖每日两次的离线采样，操作人员将离线葡萄糖测量值手动输入生物反应器控制系统，若低于触发点则添加葡萄糖脉冲至目标值。由于采样频率受限，该策略响应迟缓，葡萄糖目标值需比触发点高2 g/L以降低饥饿风险。

PAT控制策略通过OPC-UA框架实现拉曼光谱仪、Raspberry Pi与生物反应器控制系统之间的近即时数据交换。Raman系统持续更新OPC-UA服务器光谱数据，Raspberry Pi以订阅机制实时获取并进行预处理和葡萄糖浓度预测，同时计算99%预测区间上下界。生物反应器控制系统自动读取更新后的预测结果，当预测区间上界低于葡萄糖触发点时，即从预测浓度添加葡萄糖至目标值。选择预测区间上界作为触发条件，旨在最小化葡萄糖过度喂养风险并补偿随时间增加的预测波动。该策略每12.5 min即可完成一次测量-决策-执行循环，葡萄糖目标值与触发点保持一致。

PAT与手动葡萄糖反馈控制策略比较

PAT控制策略在高低两种葡萄糖喂养方案下均展现出优异的葡萄糖调控能力。高葡萄糖PAT控制策略将葡萄糖浓度分别维持于3.15±0.39 g/L（第2–5天）和5.83±0.46 g/L（第6–14天），低葡萄糖PAT策略则分别维持于1.29±0.47 g/L和3.43±0.39 g/L。PAT策略的葡萄糖泵激活次数（38–39次）约为手动控制（13次）的三倍，且激活频率随培养进程递增，与细胞生长期和蛋白表达高峰期相吻合。统计分析表明（Fligner–Killeen方差齐性检验和Mann–Whitney U检验），虽然各策略间平均葡萄糖浓度无显著差异，但第6–14天期间PAT控制显著降低了葡萄糖浓度方差（p<0.05），表明该策略能更稳定地维持目标浓度。手动控制策略在后期频繁出现葡萄糖耗尽，尤其在第3、5、9、14天，可能导致细胞凋亡。

代表性上游工艺在PAT与手动控制下的比较分析

PAT控制策略显著改善了多项工艺性能指标。VCD方面，PAT控制峰值达53×10⁶ cells/mL，高于手动控制的42×10⁶ cells/mL，且高VCD维持时间更长；低葡萄糖PAT策略获得最高VCD值，表明稳定维持较低葡萄糖水平有利于提高最大VCD和延长培养时间。细胞存活率方面，PAT控制在收获日仍高于80%，而手动控制已低于60%，提示葡萄糖喂养方式对细胞死亡的影响超过葡萄糖浓度本身。

乳酸积累在PAT控制下减少，高葡萄糖喂养导致更多乳酸产生。氨浓度方面，PAT控制产生较低的终点氨量，手动控制从第10天起氨产生急剧加速。总葡萄糖添加量在各策略间相近，但高葡萄糖PAT策略在第10–12天添加量超出对应手动控制，可能与该时期产品表达增加有关。碱添加量与乳酸水平呈正相关，PAT控制显著降低。

抗体滴度方面，PAT控制策略相比手动控制提高了高达35%，低葡萄糖PAT策略表现最优，这归因于更高的VCD和延长的细胞活力。产品质量方面，PAT控制使糖基化水平降低高达27%，表明葡萄糖浓度水平和控制策略共同影响治疗性蛋白糖基化水平，剧烈波动的高浓度设定点会增加产品结构异质性。高糖基化水平可能影响蛋白稳定性并形成晚期糖基化终产物，进而影响疗效和药代动力学。

值得关注的是，该研究所选细胞系在手动控制下表现出不良工艺特性（终点乳酸积累、低细胞存活率、高糖基化），但通过PAT控制尤其是低葡萄糖策略，显著改善了这些不良特性，使原本表现不佳的克隆转变为有竞争力的候选者。这一发现提示控制策略和喂养策略在早期细胞系开发阶段即可能发挥重要作用。

研究结论

该研究成功展示了拉曼光谱在哺乳动物细胞培养系统生物治疗生产中对工艺参数的实时监测和控制应用。通过先进的预处理技术和PLSR，拉曼光谱能够高精度预测葡萄糖浓度、乳酸浓度、VCD和抗体滴度。开发的葡萄糖预测模型被集成到稳健标准化的PAT控制策略中，通过OPC-UA框架实现了PAT传感器（拉曼光谱仪）、Raspberry Pi和生物反应器控制系统之间的信息通信与交换。PAT控制策略在不同葡萄糖喂养方案下与手动控制进行了评估比较，结果显示PAT控制改善了葡萄糖调控，减少了变异性，更稳定地维持设定点。这带来了细胞培养性能的改善，包括提高的VCD、延长的细胞活力、降低的乳酸和氨积累。此外，PAT控制方法观察到产品滴度提高高达35%、糖基化降低高达27%，凸显了其在提高产品产量和质量方面的潜力。低葡萄糖PAT控制策略展现出最优的培养性能，表明严格控制低葡萄糖微环境可改善代谢效率并延长培养时间。虽然这些结果展示了拉曼光谱赋能PAT葡萄糖控制的潜力，但仍需额外的生物反应器运行来评估这些发现在更广泛工艺条件下的普适性和可重复性。

总体而言，该研究证明了拉曼光谱作为生物过程监测和控制强大工具的价值。研究结果表明，将实时预测模型与自动化控制策略整合可以显著增强工艺稳定性、降低操作风险并提高产品质量一致性。为使标准化框架符合GMP要求，未来还需探索数据完整性和网络安全方面的额外考量，这可能需要与符合必要合规和监管标准的商业供应商密切合作。一旦解决这些集成挑战，实时控制的机遇将实现对CPP和CQA的更紧密调控，从而实现更高的生产率、简化的下游处理操作，最终加速工艺开发时间线并推动行业变革。