CREAT：一种基于CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）的基因组修剪策略，用于系统鉴定非必需区域和快速基因组缩减

《Advanced Science》：CREAT: A CRISPR-Based Genome Trimming Strategy for Systematic Identification of Dispensable Regions and Rapid Genome Reduction

　　

构建最小基因组微生物为理解基本生物学过程和合成生物学提供了一个理想平台，然而该研究受到微生物必需基因列表不完整以及具有试错性质的多轮基因组修剪的阻碍。为解决此问题，研究人员引入了CREAT（基于CRISPR的多同源臂模板基因组修剪）——一种将CRISPR靶向基因组切割和同源臂步移相结合的简化方法，以区分基因组亚区域中的必需与非必需部分，从而为预测给定生物体中的必需基因提供基础。这些必需基因随后被组装成合成基因盒，用于一步替换目标中不可删除的基因组区域，以进行进一步的基因组修剪。在Saccharolobus islandicus中连续八轮CREAT基因组修剪实现了基因组大小20.8%的缩减。此外，研究人员开发了基于Cas9的CREAT基因组修剪方法用于Bacillus subtilis和Escherichia coli，在后一种菌中，λ-Red重组酶的引入极大地提高了效率。总之，CREAT的迭代应用为快速构建多种微生物的最小基因组提供了一个可扩展且普遍适用的策略。

**研究背景与问题**
构建具有最小基因组的微生物是合成生物学和基础生命科学研究的核心目标之一，旨在阐明生命所需的最基本基因集合，并为高效生物制造提供精简的底盘细胞。传统上，实现这一目标主要有两种策略：“自下而上”地从头合成最小基因组和“自上而下”地对现有基因组进行缩减。然而，这两种策略都面临重大挑战。特别是“自上而下”的基因组缩减方法，通常依赖于通过比较基因组学、全基因组敲除筛选或转座子诱变等方法预测的必需基因列表来指导删除。这些预测往往低估了必需基因的数量，因为新的必需基因可能在特定生长条件下出现，或者由于功能冗余基因的删除导致合成致死现象。因此，尝试删除先前定义的必需基因之间的区域经常失败，最终只能通过试错方式逐步测试更小片段的删除。这个过程不仅耗时费力，而且常常不彻底，导致目标修剪区域内残留的非必需基因组片段散布在必需基因之间。

**研究概述与意义**
为了应对上述长期存在的挑战，本研究开发了一种名为CREAT（CRISPR-based genome trimming with a multi-homology-arm template，基于CRISPR的多同源臂模板基因组修剪）的简化基因组修剪策略。该策略整合了CRISPR-Cas介导的基因组靶向和“同源臂（HA）步移”方法，能够系统地区分给定基因组片段内的必需与非必需亚区域。随后，非必需亚区域被精确删除，并由包含已鉴定必需基因的合成盒所替代，从而一步实现基因组的修剪。该方法成功应用于泉古菌模型Sa. islandicus，并扩展到两种细菌模型：B. subtilis和E. coli。该研究发表于《Advanced Science》，为快速、系统化地构建多种微生物的最小基因组提供了一种通用且高效的新工具。

**关键技术方法**
研究人员主要采用了以下关键技术：1. **基于内源CRISPR-Cas或Cas9的基因组编辑系统**：在Sa. islandicus中利用其内源的IA型CRISPR-Cas系统，在B. subtilis和E. coli中利用化脓性链球菌Cas9（SpCas9）系统，实现靶向DNA双链断裂。2. **同源臂（HA）步移分析**：将目标基因组区域划分为多个亚区域，并设计一系列相邻的同源臂组装成修复模板。通过CRISPR靶向切割后，修复模板上的不同同源臂组合与染色体发生同源重组，产生一系列携带不同缺失模式的重组子，从而系统鉴定出必需、准必需和非必需亚区域。3. **合成必需基因模块的组装与替换**：在鉴定出必需基因后，将其编码序列组装成“必需基因同源臂（egHA）”，用于构建新的修复模板，一步实现非连续非必需区域的删除和必需基因模块的替换。4. **λ-Red重组工程增强**：在E. coli中，引入λ-Red（Gam/Bet/Exo）重组系统，显著提高了短同源臂之间的重组效率和编辑结果的多样性。研究所用菌株包括Sa. islandicus E233S（源自REY15A）、B. subtilis 168和E. coli MG1655。

**研究结果**
^2.1 **基于经典CRISPR的大基因组片段删除分析揭示了Sa. islandicus基因组中额外的必需基因**
研究人员首先对Sa. islandicus REY15A中六个预测的非必需大区域（gS1-gS6）进行基于内源CRISPR的删除尝试。结果发现，仅gS4区域（199 kb）能被成功删除，而其他五个区域的删除均未获得存活突变体，表明这些区域内存在先前未预测到的必需或准必需基因。对最大的gS2区域（293 kb）进行细分删除测试进一步证实，成功的删除在很大程度上依赖于试错。

^2.2 **同源臂步移能够快速分类给定基因组片段中的非必需、必需和准必需亚区域**
为系统解决问题，研究人员设计了同源臂（HA）步移方法。以gS1区域（80.5 kb）为例，将其划分为4个亚区域并设计5个HA。通过CRISPR靶向切割和包含所有HA的修复模板，一次性获得了多种缺失组合的重组子。分析显示，所有存活重组子都保留了gS1-sR2或gS1-sR4亚区域，表明这两个区域可能含有功能冗余的必需基因。随后在gS3区域（79 kb）的验证实验也成功鉴定出其内部的必需亚区域（gS3-sR5和gS3-sR8）。该方法还能识别出具有生长竞争优势的缺失组合。

^2.3 **通过用必需基因的合成组装体替换原始基因组片段来重建古菌基因组**
在通过HA步移鉴定出必需亚区域和候选必需基因后，研究人员将这些基因组装成“必需基因同源臂（egHA）”，并用于替换原始基因组区域。例如，在gS1区域，引入候选必需基因SiRe_0319或SiRe_0355的egHA后，成功删除了gS1-sR2-4区域，证实了这两个基因的功能冗余性。在gS3区域，包含SiRe_0880（推测为古菌糖基化R蛋白，aglR）的egHA使得整个gS3区域被成功替换。通过将CREAT策略迭代应用于Sa. islandicus的8个基因组区域，最终实现了20.8%（525.2 kb）的基因组缩减，产生了基因组缩减菌株。

^2.4 **基于Cas9的CREAT方法促进B. subtilis中不连续非必需DNA片段的基因组修剪**
研究人员将CREAT策略拓展至细菌B. subtilis。针对两个选定的基因组区域（bsDel1和bsDel2），利用Cas9系统和多HA修复模板进行编辑。对于bsDel1区域，HA步移获得了所有理论缺失组合的突变体，证实了该区域蛋白编码基因的非必需性。对于bsDel2区域，分析揭示了两个亚区域（HA1-2和HA3-4）中的基因存在合成致死关系。通过将其中一个候选冗余基因（bsaA，编码枯草硫醇过氧化物酶）纳入修复模板，成功获得了缺失bsDel2区域的存活突变体。

^2.5 **在E. coli中利用λ-Red重组工程促进基于Cas9的CREAT策略**
为克服长修复模板构建的限制并提高重组效率，研究人员在E. coli中将λ-Red重组系统与CREAT结合（CREAT-Red）。优化实验表明，200 bp长度的HA（RT200）在诱导λ-Red表达时能产生最多样化和高效的编辑结果。应用CREAT-Red对两个E. coli基因组区域（EcDel1和EcDel2）进行修剪，成功鉴定并整合了多个必需基因和tRNA编码基因，构建了基因组缩减菌株。例如，在EcDel2区域，鉴定出包含支链氨基酸生物合成基因、rho操纵子以及肠杆菌共同抗原（ECA）合成相关基因簇的必需区域，同时证实了wzxE、wecF、wzyE和rffM等ECA合成相关基因在E. coli MG1655中是非必需的。

**讨论与结论**
**讨论部分**指出，CREAT策略通过HA步移系统绘制基因必需性图谱，并重建携带新鉴定必需基因合成盒的突变体，实现了对目标基因组片段内必需与非必需区域的精确分类，以及非必需序列的一步删除和替换。与需要多轮试错删除的传统方法相比，CREAT将多轮功能评估整合为一步多重化程序，直接产生最大程度修剪或表型优化的突变体。尽管CREAT具有优势，但也存在一些局限性：例如，由于同源重组的内在偏好性，未能获得重组子可能被误判为区域必需；初始亚区域大小（5-20 kb）的设置可能导致单个必需基因与多个必需基因的混淆；不同基因组区域基因间的合成致死相互作用可能导致准必需基因被误分类为必需基因。通过结合λ-Red等辅助重组系统，可以提高重组效率和多样性，未来有望进一步拓宽CREAT在各种微生物系统中的适用性。

**研究结论**部分翻译如下：总而言之，研究人员开发了CREAT，一种新的基因组修剪策略，包含两个连续步骤：（i）通过HA步移方法系统分类非必需与必需/准必需亚区域；（ii）鉴定其中的新必需基因，并用包含所有已鉴定必需基因的合成DNA片段替换原始基因组片段。这种集成的遗传方案为系统鉴定所有非必需部分以及一步去除给定基因组片段中不连续的非必需区域提供了首个方法，从而产生基因组缩减菌株，用于对所需基因组片段进行迭代CREAT分析，最终产生具有精确设计缺失的基因组缩减菌株。