在AL淀粉样变性这种疾病中，全长免疫球蛋白轻链蛋白的展开以及随后的异常蛋白水解是形成淀粉样轻链沉积物的必要条件，而AL淀粉样变性属于系统性淀粉样变性的一种[1]。正常情况下可溶的轻链在多种组织中积累成淀粉样纤维，进而导致器官功能逐渐恶化，最终可能致命[2, 3]。此外，错误折叠的可溶性轻链还会引发心脏毒性，这是该疾病导致死亡的主要原因[3]。全长轻链是抗体中的亚单位，通常在免疫系统中发挥作用，用于识别抗原[4]。抗体是由两个全长轻链和两个重链通过共价键连接而成的四聚体，它们与“游离”的轻链单体及二聚体一同存在于血液中——为了高效分泌抗体，机体会产生过量的全长轻链[5]。如果某个异常的克隆细胞群过度产生某种单一的游离轻链，就会导致该轻链片段在组织中以淀粉样纤维的形式积累。每位AL淀粉样变性患者的轻链序列都具有独特性，正是这些序列会形成淀粉样蛋白[6]。每种轻链的氨基酸序列似乎决定了它发生聚集的倾向[4, 7]。淀粉样蛋白的形成还与游离的全长轻链或其片段的浓度升高有关，因此现有的治疗方法是通过杀死那些异常的克隆细胞来降低整体具有淀粉样变性倾向的轻链浓度[2, 3]。另一种可能毒性更低的办法则是防止已分泌的轻链发生错误折叠和聚集。通过小分子调控蛋白质的组装、折叠和稳定性，已成为一类重要的药物，这类药物可针对多种疾病相关的蛋白质[8]。动力学稳定剂就是这类分子中的一类，它们能够选择性地与蛋白质的天然状态结合，从而减缓蛋白质的展开速度。对循环中的轻链进行动力学稳定处理，可以保护剩余的游离轻链免于错误折叠、异常蛋白水解和聚集，从而弥补细胞毒性化疗的不足[9]，目前这一理念正在临床试验中得到验证。
轻链分为κ型和λ型两种，其中λ型轻链在AL淀粉样变性中的作用更为常见[3, 6, 10]。全长轻链是一种由210–220个氨基酸残基组成的蛋白质，它能折叠成两个独立的结构域：可变结构域（VL）和恒定结构域（CL）[4, 5]。这两个结构域都呈β折叠结构，即免疫球蛋白折叠结构，这种结构由分子内的二硫键维持稳定。N端的可变结构域（在图1B和1C所示的序列中对应1–113号残基）在融入抗体后，可通过三个高度多态性的环——即互补决定区与抗原结合[1C]。而其他被称为框架区的残基段则具有更高的保守性。C端的恒定结构域（对应114-219号残基）在抗体中具有结构功能，而且不同轻链之间的这一序列具有高度保守性。游离的全长轻链在血液循环中可以形成二聚体。这类游离轻链二聚体的结构是平行的，其中一个单体的VL结构和CL结构域会与另一个单体中的相应结构域相互结合[1A]。β链中的CV、C’V、FV和GV残基构成了VL-VL界面，而β链中的DC、EC、BC和AC残基则构成了CL-CL界面。在CL结构域的C端附近有一个半胱氨酸残基（此处以序列对齐为准，称为C218），它可以在二聚体内部形成分子间的二硫键。在患者体内，具有淀粉样变性倾向的全长轻链既可以形成单体，也可以形成二聚体[11, 12, 13]。
患者体内的淀粉样纤维的结构核心主要由VL结构域的残基构成，这些残基处于非天然的、交叉的β折叠构象中[14, 15]。在温和的体外条件下，分离出的VL结构域就有可能发生聚集，而全长轻链在相同条件下却能保持较长时间的溶解状态，且抗聚集能力更强[16, 17, 18]。与普通VL结构域相比，与淀粉样蛋白相关的VL结构域更容易展开并聚集，不过不同样本的聚集速率也存在很大差异[7, 19, 20, 21, 22]。此外，与淀粉样蛋白相关的全长轻链在结构稳定性上也低于普通类型，它们更容易发生局部或整体的展开，进而引发异常的内源蛋白水解，释放出容易聚集的片段，其中包括VL结构域[16, 23, 24, 25, 26]。在某些情况下，蛋白水解会在聚集之后才发生[27]。由VL结构域形成的淀粉样纤维可能会加速或促使全长轻链的聚集[18]。
综合这些数据可以看出，蛋白质中一些敏感区域的局部结构动态起着重要作用。这些敏感区域可能包括：i）游离轻链中的结构域间界面，比如VL-VL界面和VL-CL界面[28, 29, 30]；ii）VL结构域内的分子内二硫键所在区域，这一区域在淀粉样蛋白形成过程中会发生展开[14, 31]；iii）促淀粉样形成区域，这类区域具有较高的内在聚集倾向，被认为会引发蛋白质的错误折叠[31, 32, 33]；iv）CL结构域的突变、错误折叠或蛋白水解[23, 26, 34, 35, 36]。对于不同的轻链序列而言，这些敏感区域在淀粉样蛋白形成过程中的作用可能有所不同，这也给针对它们的药物设计带来了难度。
由于轻链的序列种类繁多，且目前没有天然的小分子配体，因此历史上它们一直被视为难以开发的药物靶点[37]。尽管如此，我们还是通过高通量筛选找到了一些小分子，这类分子能够保护已折叠的全长轻链，避免其结构发生异常变化从而导致蛋白水解，我们将这类分子称为轻链动力学稳定剂。这类分子会与轻链二聚体中VL-VL界面处高度保守的残基结合[38]（见图1B，彩色标注的残基）。稳定剂的结合能够增强两个VL结构域之间的二聚化亲和力。对于那些没有分子间二硫键、只能在单体和二聚体状态之间转换的VL结构域和全长轻链来说，稳定剂的结合会增加溶液中二聚体所占的比例。在通过二硫键连接而成的二聚体中，稳定剂的结合被认为可以抑制结构域的运动以及短暂的展开。后续基于结构的设计工作使得我们得到了效力更高的动力学稳定剂[1D][39, 40, 41, 42, 43]。对这些候选分子的筛选和优化主要是在一种名为WIL-FL的全长轻链蛋白上进行的。当前药物开发面临的一个关键挑战，就是找到能够紧密且特异性地与多种不同序列的轻链结合的动力学稳定剂。这类稳定剂通过强化轻链二聚体中VL-VL结构域界面，从而减缓轻链的展开速度，进而降低蛋白水解和聚集的概率。不过，目前还没有通过实验研究过这类小分子动力学稳定剂对与淀粉样变性相关的更多种类全长轻链的局部展开和蛋白水解过程的影响。
为了研究多种全长轻链的结构动态，我们采用了氢-氘交换质谱技术。此前，我们就曾使用这种技术研究过分离出的VL结构域、全长轻链以及IgG蛋白的天然结构与动态特性，以此找出那些可能促使蛋白质错误折叠、进而引发异常蛋白水解的关键区域[31, 32, 44]。在本次研究中，我们分析了九种不同全长轻链的局部展开情况，以及小分子动力学稳定剂结合后对这些动态特性的影响。我们所研究的稳定剂包括筛选得到的候选分子（P1和P5，见图1D），以及基于结构设计而成的稳定剂（B20、M63、M53和M83）。我们详细阐述了这些稳定剂的作用机制，也为开发治疗AL淀粉样变性的新疗法提供了理论依据。
