细胞吞噬界定结直肠癌中与临床结局相关的空间分离竞争性代谢微生态位

《Cell Death & Differentiation》：Cell engulfment defines spatially distinct competitive metabolic niches associated with clinical outcomes in colorectal cancer

　　

摘要：细胞竞争（Cell Competition）是一种新兴机制，哺乳动物组织通过直接相互作用由适应性更强（胜者/Winner）的邻近细胞清除适应性较低（败者/Loser）的细胞来维持稳态。在癌症中，此类竞争性相互作用可驱动肿瘤演化；然而，这些事件的空间组织结构及其临床相关性仍知之甚少。胜者细胞清除败者细胞的一种机制是吞噬（Engulfment），形成胞内胞（Cell-in-Cell, CIC）结构。尽管CIC在多种肿瘤中被观察到一个多世纪，其细胞组成、空间背景、与肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）的相互作用及在人类癌症中的生物学意义尚不清楚。本研究利用大样本结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）患者队列的空间分辨单细胞数据，系统表征了原位CIC结构的细胞身份与功能状态，考察其在TME中的空间相互作用，并评估其临床相关性。研究人员证实CIC主要发生在癌细胞之间，但也涉及癌干细胞样（Cancer Stem Cell-like, CSC-like）群体和细胞毒性T细胞。被吞噬（内层/Inner）的癌细胞及CSC-like细胞表现出与败者细胞表型一致的分子特征，包括凋亡增加和增殖降低；而外层（Outer）癌细胞则呈现胜者细胞特征，如糖酵解（Glycolysis）上调。活细胞延时实验证明，细胞吞噬后溶酶体降解过程中葡萄糖积聚于内层细胞。空间分析进一步揭示了基于吞噬事件发生邻近区域定义的独特CIC邻域（CIC Neighbourhoods），该区域内细胞（特别是CSC-like细胞和细胞毒性T细胞）表现出代谢应激增强，提示局部营养竞争。重要的是，CIC邻域内存在细胞毒性T细胞以及癌细胞与CSC-like群体的空间共存与患者较好预后相关。综上，研究结果表明细胞吞噬界定了空间组织化的竞争性微生态位，反映了复杂肿瘤微环境中的细胞竞争。

论文解读：细胞吞噬界定结直肠癌中与临床结局相关的空间分离竞争性代谢微生态位

细胞竞争（Cell Competition）是进化保守过程，正常组织中通过直接接触比较细胞适应性并清除低适应性（Loser）细胞以维持稳态和上皮完整性，涉及JNK信号、BCL-2家族蛋白及MYC等癌基因调控。在结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）中，KRAS、TP53、MYC、EGFR等突变可使癌细胞获得Winner细胞地位并可能通过Entosis（一种细胞吞噬形式）清除邻近Loser细胞形成胞内胞（Cell-in-Cell, CIC）结构。然而，人类肿瘤中CIC的实际细胞身份、空间分布、与免疫微环境的相互作用及临床意义长期未明，既往研究对CIC预后价值报道矛盾（部分癌种提示不良、部分提示良好），且缺乏空间分辨的原位表征。本文利用空间多重免疫荧光成像结合大样本CRC组织微阵列（TMA），旨在明确CIC的细胞组成、内外层细胞的代谢/凋亡/增殖状态、CIC周围微环境的空间特征及其与患者临床结局的关系。该论文发表于《Cell Death & Differentiation》。

主要关键技术方法：

研究人员收集148例I–III期CRC患者的福尔马固定石蜡包埋（FFPE）原发灶构建组织微阵列（TMA，每例3个核，共444个核），采用Cell DIVE多重免疫荧光（Multiplex Immunofluorescence, MxIF）技术检测60种蛋白标志物进行单细胞分割与分型（癌细胞CDX2⁺PCK26⁺、CSC-like细胞ALDH^highKI67^low、细胞毒性T细胞CD3⁺CD8⁺等）。手动注释符合6项形态学标准中≥5项的CIC结构。活细胞共聚焦显微成像（HCT116及HCT116-Jurkat共培养）用2-NBDG和Lysotracker监测葡萄糖摄取与溶酶体降解。空间分析定义CIC中心20 μm内为"CIC邻域（CIC Neighbourhoods）"，计算共现概率（Co-occurrence）、最近邻富集（Nearest-neighbour Enrichment）及接近中心性（Closeness Centrality），并结合Kaplan–Meier生存分析与Cox比例风险模型评估临床相关性。

研究结果：

CICs predominantly occur between cancer cells and are associated with reduced cytotoxic T cell levels（CIC主要发生于癌细胞间且与细胞毒性T细胞减少相关）：

通过对344个肿瘤核中743,429个单细胞分类，发现CIC阳性核中细胞毒性T细胞（Cytotoxic T cell/T_cyt）比例显著低于CIC阴性核。443个CIC中86.4%为癌细胞-癌细胞同质吞噬，其余涉及CSC-like细胞（~10%，含被吞噬或作为外层）、T_cyt（2.5%）及单核细胞（1.2%）。表明CRC中CIC以同质癌细吞噬为主，CIC区域伴随局部T细胞浸润减少。

Inner and outer cells exhibit metabolic and apoptotic profiles consistent with cell competition（内层与外层细胞呈现符合细胞竞争的代谢与凋亡谱）：

比较CIC内外层癌细胞与非吞噬癌细胞蛋白表达：内层癌细胞BAX、BAK下调，cleaved CASP3（CL-CASP3）升高；外层癌细胞GLUT1、HK2、PKM2、LDHA等糖酵解相关蛋白上调，KI67略降。CSC-like内层细胞亦显示CL-CASP3升高、CMYC降低（Loser表型）。被吞噬T_cyt高表达GRP78、LDHA、CMYC但无CL-CASP3升高。说明CIC内外层分别呈现Loser（高凋亡倾向、低增殖、代谢重编程）与Winner（高糖酵解）特征，符合细胞竞争模型。

CICs exhibit increased glucose uptake during lysosomal degradation of inner cells（CIC内层细胞溶酶体降解期间葡萄糖摄取增加）：

HCT116活细胞延时成像显示，早期CIC（Lysotracker阴性）2-NBDG水平与邻近细胞相当；进入晚期降解阶段（Lysotracker阳性）内层细胞2-NBDG荧光强度约升高4倍，与溶酶体激活部分共定位。异质CIC（癌细胞吞噬Jurkat T细胞）中内层T细胞同样出现2-NBDG蓄积。免疫荧光证实降解中内层细胞GLUT1升高。提示内层细胞启动溶酶体降解时伴随瞬时葡萄糖摄取激增，外层Winner细胞可能随后获取降解产物营养。

CICs are associated with invasive and mesenchymal clinicopathological features in CRC（CIC与CRC侵袭性及间质分子特征相关）：

CIC存在于75.6%患者中，检出率与年龄、性别、TNM分期、MSI状态、CMS亚型总体无显著关联，但在伴淋巴管浸润（LVI）及壁外静脉浸润（EMVI）肿瘤中CIC计数显著更高，CMS4（间质型）较CMS3更多见。CIC有无本身未达显著总生存（OS）或无病生存（DFS）差异。

CIC neighbourhoods define spatial niches enriched in CSC-like cells and are associated with metabolic adaptations and T cell-dependent survival（CIC邻域定义富集CSC-like细胞的空间微生态位并与代谢适应及T细胞依赖生存相关）：

以CIC几何中心20 μm半径定义邻域，该区癌细胞、巨噬细胞、CSC-like细胞及T_cyt比例高于全瘤平均，其中CSC-like细胞具最高共现与最近邻富集评分（非随机空间关联）。距CIC越近，多种细胞GLUT1与GRP78表达呈距离依赖性梯度上升（尤以T_cyt和CSC-like明显），提示局部代谢应激/葡萄糖匮乏。CIC邻域内存在T_cyt（或所有T细胞）的患者随访期内无死亡事件，提示预后较好。

Spatial co-occurrence of CICs and CSC-like cells is an independent predictor of improved clinical outcome（CIC与CSC-like细胞空间共存是改善临床结局的独立预测因子）：

构建细胞–细胞互作网络并计算患者水平共现评分：CIC–CSC-like细胞共现越高，DFS越好（HR=0.04, p=0.031），独立于年龄、性别、分期及辅助化疗；而CIC–癌细胞或CIC–T_cyt共现无此关联。辅助化疗患者CIC–CSC-like共现评分降低，提示化疗重塑CIC邻域空间互作。CIC过高接近中心性（Closeness Centrality）预示较差结局。

讨论与结论（翻译浓缩）：

细胞竞争通过Winner细胞诱导凋亡、挤出或吞噬（Entosis）清除Loser细胞。本研究在人CRC组织中系统证明CIC即细胞吞噬事件代表空间组织的"CIC邻域"，具备细胞竞争分子特征——内层（Loser）凋亡标志升高、外层（Winner）糖酵解（GLUT1等）上调，且CIC邻域局部出现营养竞争导致的代谢应激梯度。新发现包括约10% CIC涉及CSC-like细胞，被吞噬CSC-like呈Loser表型，且CIC与CSC-like空间共存是患者DFS改善的独立预测因子，可被辅助化疗改变。活细胞实验证实内层细胞溶酶体降解期葡萄糖瞬态积聚。CIC邻域存在细胞毒性T细胞与较好预后相关，但CIC区域整体T细胞密度偏低，提示复杂免疫互作（吞噬T细胞、代谢竞争抑制T细胞功能并存）。BCL-2家族蛋白（BAK/BAX低表达）可能决定内层细胞命运（降解vs逃逸），或参与免疫逃避。局限性含固定组织无法捕捉动态、样本量对某些亚组统计力有限等。综上，细胞吞噬界定了CRC中具有临床意义的空间竞争性代谢微生态位，CIC及其邻域空间组成与互作可提供预后信息并反映肿瘤内细胞竞争。