克隆分析揭示造血干细胞与祖细胞老化对T细胞发育的影响

《Aging Cell》：Clonal Analyses Reveal the Impact of Hematopoietic Stem and Progenitor Cell Aging on T Cell Development

　　

胸腺T细胞输出在整个生命过程中持续下降，并伴随胸腺基质（thymic stroma）的深度重塑。由于造血干细胞与祖细胞（hematopoietic stem and progenitor cells, HSPCs）的异质性、HSPCs迁移的多阶段过程，以及胸腺内造血成分与基质成分之间的相互串扰，衰老导致的T细胞输出下降在多大程度上源于HSPCs老化，始终难以明确界定。为解析HSPCs老化对T细胞发育的贡献，研究人员利用人工胸腺类器官（Artificial Thymic Organoid, ATO）系统，对来自年轻与老年骨髓、经表型界定的HSPCs之T细胞分化进行了研究。该体外模型可在受控微环境中，对单个HSPCs的T细胞分化进行定量分析。表型分析显示，年轻骨髓中的大多数HSCs为CD150_lo淋巴系偏倚（lymphoid-biased, Ly-HSC）细胞，而老年HSCs则以CD150_hi髓系偏倚（myeloid-biased, My-HSC）细胞为主。克隆分析表明，Ly-HSCs具有高于My-HSCs的T细胞生成潜能，但对于相同免疫表型（immunophenotypic）的HSC而言，衰老对其T细胞输出几乎没有影响或影响极小。进一步地，对早期胸腺祖细胞（early thymic progenitors, ETPs）的克隆研究显示，年轻与老年细胞具有可比的T细胞潜能。研究人员据此得出结论：衰老过程中造血系统对胸腺功能不全的贡献，很可能主要源于老年骨髓中髓系偏倚HSCs的相对增加，而并非广义上所有HSPCs在单细胞水平T细胞潜能的普遍丧失。衰老期间胸腺微环境发生的显著变化，也很可能是胸腺生成（thymopoiesis）缺陷的重要致病因素。

本文发表于《Aging Cell》，围绕“衰老过程中T细胞生成减少究竟有多少应归因于造血细胞本身老化”这一核心问题展开。研究背景在于，机体免疫功能随年龄增长而衰退，老年个体常出现疫苗应答减弱、感染与肿瘤易感性增加等现象。T细胞作为适应性免疫的关键组成，其生成依赖骨髓造血干细胞（hematopoietic stem cells, HSCs）及祖细胞迁移至胸腺后，在胸腺微环境支持下完成谱系承诺与分化。然而，衰老时胸腺微环境会发生明显退化，胸腺细胞数与T细胞输出大幅下降。既往研究虽提示老年造血干/祖细胞（hematopoietic stem and progenitor cells, HSPCs）存在功能改变，但由于移植实验需要经历归巢、植入、扩增、再迁移至胸腺等多个步骤，且常受到预处理照射对骨髓和胸腺微环境的干扰，因此难以直接分辨T细胞生成下降究竟来自HSPCs内在缺陷，还是来自骨髓与胸腺微环境改变。此外，HSCs本身具有显著异质性，尤其包括淋巴系偏倚HSC（Ly-HSC）和髓系偏倚HSC（My-HSC）两类亚群，而衰老常伴随My-HSC比例上升，这进一步增加了解释难度。正因如此，开展一项在可控微环境中、以单细胞克隆水平定量评估不同HSPCs T细胞分化潜能的研究，具有明确必要性。

研究人员采用人工胸腺类器官（Artificial Thymic Organoid, ATO）体系，对年轻与老年小鼠来源、经流式分选明确定义的骨髓HSPCs、HSCs、Ly-HSCs、My-HSCs及胸腺早期胸腺祖细胞（early thymic progenitors, ETPs）进行了体外分化研究。主要结论是：衰老并未显著降低相同表型HSC单细胞的T细胞潜能；决定T细胞生成能力的关键因素主要是HSC的谱系偏倚属性而非年龄本身。Ly-HSC无论来自年轻还是老年骨髓，均表现出强于My-HSC的T细胞分化潜能；老年骨髓中T细胞生成能力下降，更可能是因为HSC池组成发生改变，即My-HSC相对富集、Ly-HSC比例下降，而非每个老年HSC都普遍失去T细胞潜能。与此同时，老年ETPs虽然数量明显减少，但其单细胞水平的T细胞分化能力与年轻ETPs相近。该研究的重要意义在于，将衰老相关胸腺功能不全重新界定为“造血池组成偏移”与“胸腺微环境老化”共同作用的结果，而非简单归因于HSPCs全面功能衰退，这为今后同时靶向骨髓与胸腺微环境以恢复老年T细胞输出提供了理论基础。

研究人员主要采用以下关键技术方法：首先，使用年轻（7–8周龄）与老年（18–24月龄）C57BL/6J雌雄小鼠作为样本来源，分别获取骨髓与胸腺细胞；其次，利用流式细胞术（FACS）分选LSK、HSC、CD150_lo Ly-HSC、CD150_hi My-HSC及ETP等细胞群；再次，建立批量与单细胞人工胸腺类器官（ATO）培养体系，以MS5-mDLL4基质细胞提供受控Notch信号环境；随后，通过细胞计数与多参数流式分析，评估DN1–DN4、ISP8、DP、SP4、SP8等T细胞分化阶段及髓系细胞生成；最后，辅以指数分选、克隆效率分析以及ETP凋亡/细胞周期检测，对衰老影响进行定量比较。

以下为论文主体结果的分段解读。

2.1 T Cell Output and Differentiation From Bone Marrow Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) During Aging
研究人员首先确认，随年龄增长，小鼠胸腺细胞总数显著下降，符合胸腺老化的经典特征。随后在ATO体系中比较年轻与老年骨髓LSK细胞以及HSCs的T细胞发育表现。结果显示，无论年龄与性别如何，LSK或HSC在ATO中的总细胞产量总体相近，提示老化并未明显削弱这些起始细胞的总体增殖/扩增能力。但在分化动力学方面，年轻来源细胞明显更快进入后续T细胞发育阶段：年轻LSK在第1周即可较多到达DN2，而老年LSK多停留于DN1；第3周时，年轻LSK培养物中双阳性细胞（double positive, DP）更多，而老年LSK仍以较早的DN阶段为主。对于更原始的HSC，分化整体较LSK更晚，但同样呈现年轻HSC较快推进至DN3和DP阶段、老年HSC相对滞后的现象。由此可见，衰老主要影响的是骨髓HSPCs向T细胞谱系推进的速度，而不是早期培养中的总输出量。

2.2 Aged HSCs Produce More Myeloid Cells in Vitro and Contain a Greater Proportion of Myeloid-Biased HSCs
在评估T细胞分化过程中，研究人员注意到部分ATO培养物中存在明显非T谱系细胞。进一步分析表明，这些非T细胞主要为髓系细胞（myeloid cells），并且老年HSCs在ATO中产生的髓系细胞频率和数量更高。随后研究人员考察骨髓HSC组成变化，发现尽管年轻与老年小鼠后肢骨总骨髓细胞数无显著差异，但老年骨髓中LSK和CD150⁺CD48^- HSC的频率和绝对数均升高。更关键的是，老年HSC池主要由CD150_hi My-HSC构成，而年轻骨髓中则以CD150_lo Ly-HSC更为常见。尽管由于老年HSC总数增加，Ly-HSC与My-HSC绝对数在老年中都可升高，但比例构成已明显向髓系偏倚转变。将纯化的Ly-HSC与My-HSC分别置于ATO培养后发现，My-HSC无论来自何种年龄，均比Ly-HSC产生更多髓系细胞。这一结果说明，衰老相关髓系输出增强，与HSC池中My-HSC富集及其固有谱系偏倚特征密切相关。

2.3 T Cell Potential is Higher From Single Ly-HSC Than My-HSC Regardless of Age
为避免群体培养掩盖单细胞异质性，研究人员建立了单细胞ATO体系，对单个年轻或老年Ly-HSC、My-HSC进行克隆分析。结果显示，Ly-HSC的克隆产量显著高于My-HSC，但同一表型内年轻与老年细胞的单克隆细胞产量并无显著差异，提示决定克隆输出的关键是HSC表型而非年龄。进一步以是否产生T细胞相关标志或到达DN2/DN3阶段定义“T细胞潜能”，发现Ly-HSC来源克隆中约77%具有T细胞潜能，而My-HSC仅约43%，差异显著。且这种优势在年轻与老年组中均存在：年轻Ly-HSC和老年Ly-HSC都显著优于各自年龄匹配的My-HSC。虽然老年Ly-HSC较年轻Ly-HSC呈现轻度下降趋势，但未达到统计学显著性。分化过程分析还表明，Ly-HSC来源克隆更快通过DN阶段，在第4周即可产生更多DN3细胞，第6周可形成更多DP细胞；相反，My-HSC来源克隆常滞留于DN1等更早阶段。值得注意的是，一旦克隆完成T谱系承诺并进入后续成熟过程，则成熟单阳性CD4（SP4）和单阳性CD8（SP8）细胞的频率和数量并不受起始HSC年龄或偏倚类型显著影响。这说明衰老并未系统性削弱已具备T细胞分化能力的单个HSC，其关键差别主要体现在进入T谱系的概率，以及Ly-HSC与My-HSC之间固有的早期分化差异。

2.4 Categorization of Clones Based on Lineage Differentiation
为系统总结单克隆输出特征，研究人员将各ATO克隆划分为四类：仅T谱系（T only）、T/髓系混合（T/myeloid）、仅髓系（myeloid only）和未定型（indeterminate）。结果显示，Ly-HSC来源克隆多数属于T only或T/myeloid，且在培养第4周与第6周均有更高比例形成明确T谱系输出；My-HSC来源克隆则更常出现indeterminate以及myeloid only表现，并在第6周保留更多T/myeloid混合谱系克隆。所谓indeterminate克隆通常全部停留在DN1阶段，部分表型近似早期胸腺祖细胞（ETP），提示这类克隆可能尚未进入明确T分化程序，或产生了并非真正T谱系的早期样细胞。该部分结果进一步证明，My-HSC固有地更倾向髓系输出并较少形成纯T谱系克隆，而且这一特征不依赖年龄。

2.5 Early Thymic Progenitors (ETPs) From Young and Aged Mice Exhibit Similar T Cell Output and Differentiation Kinetics in Vitro
在胸腺内源性前体层面，研究人员进一步分析ETPs。结果表明，老年胸腺中ETP频率下降，而由于胸腺总细胞数显著减少，老年小鼠每个胸腺的ETP绝对数也明显降低。尽管如此，在单细胞ATO培养中，年轻与老年ETPs的克隆效率差异不显著；所有成功生长的ETP克隆均表现为T only，未见髓系分化证据。更重要的是，不同时间点上，年轻与老年ETPs在总细胞产量、DN向ISP8和DP推进的分化动力学，以及成熟TCRβ⁺CD3⁺、SP4、SP8细胞的形成方面均基本相当。研究人员还补充比较了年轻成年与老年ETPs的凋亡和细胞周期状态，未发现显著差异。由此说明，ETP层面的主要年龄相关变化是数量减少，而非单细胞T细胞潜能的明显内在衰退。

综合讨论部分，本文的核心贡献在于借助均一、可控的ATO微环境，将HSPCs老化对T细胞发育的影响拆解为“细胞内在潜能”与“群体组成改变”两个层面。研究结果不支持“老年HSC普遍失去T细胞分化能力”这一简单模型，而支持另一种解释：老年骨髓中My-HSC比例上升、Ly-HSC比例下降，使整体HSC池表现出较弱的T细胞生成倾向；与此同时，胸腺微环境老化极可能进一步加剧T细胞生成不足。对于ETP而言，老化导致其数量减少，但其单细胞T细胞潜能基本保留，提示胸腺输出衰减更可能与胸腺生态位改变、前体输入不足或其他上游调控异常相关。论文也指出，ATO体系的优势是排除了老年胸腺炎症环境与基质变化的干扰，但这同时意味着其不能直接再现体内促炎状态、胸腺上皮细胞减少与脂肪化增加等因素可能对微弱内在缺陷的放大作用。因此，本文对“造血因素”的界定更强调组成偏移，而非否认微环境在胸腺衰老中的主导作用。

研究结论部分可译为：研究人员认为，衰老过程中造血系统对胸腺功能不全的贡献，很可能主要源于老年骨髓中髓系偏倚HSCs的相对增加，而不是广义上HSPCs在单细胞水平T细胞潜能的普遍丧失。衰老期间胸腺微环境发生的深刻变化，也很可能是胸腺生成缺陷的重要原因。总体而言，该研究通过单细胞克隆尺度的直接证据，重塑了对免疫衰老中T细胞生成障碍来源的认识，并提示恢复老年T细胞输出的干预策略或需同时针对骨髓HSC组成与胸腺微环境两方面展开。