纵向单细胞及T细胞受体（TCR）库谱系分析揭示错配修复功能正常/微卫星稳定型局部晚期直肠癌患者中的克隆陷俘现象

《Cell Discovery》：Longitudinal single-cell and TCR repertoire profiling characterizes clonal entrapment in patients with pMMR/MSS locally advanced rectal cancer

　　

在免疫检查点抑制剂（ICI）治疗的热肿瘤中，治疗前肿瘤内免疫炎症水平升高通常与更好的疗效相关。然而，研究人员在错配修复功能正常/微卫星稳定型（pMMR/MSS）局部晚期直肠癌（LARC）患者中观察到了一个矛盾现象：部分基线免疫炎症水平升高的患者在接受放疗联合ICI治疗后，疗效反而低于免疫炎症水平较低的患者。为探究这一反直觉的发现，研究人员对20例接受序贯放疗和ICI治疗的pMMR/MSS LARC患者（NCT06493240）的纵向采集样本进行了配对的单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞TCR测序（scTCR-seq），样本包括肿瘤活检（治疗前、放疗后、免疫治疗后）和外周血单个核细胞（治疗前和免疫治疗后）。研究人员提出"克隆陷俘"（clonal entrapment）概念来解释这一现象。具体而言，谱系分析结果显示，树突状细胞中HLA-DQA2表达增加以及治疗抵抗性肿瘤细胞中GDF15上调，与新型肿瘤反应性TCR克隆型的限制性扩增相关。 consequently，免疫反应主要受肿瘤内预先存在的TCR克隆型限制，特别是那些在慢性炎症下部分扩增的克隆型，导致ICI治疗后主要扩增来自治疗前CD8⁺ T细胞库的TCR克隆型。通过识别pMMR/MSS LARC微环境的这一特征，该研究为理解序贯放疗和ICI治疗抵抗提供了高分辨率的分析框架。

结直肠癌（CRC）是全球第三大常见恶性肿瘤及第二大癌症死亡原因，其中中国69.6%的直肠癌病例诊断为局部晚期直肠癌（LARC）。尽管免疫检查点抑制剂（ICI）在错配修复缺陷/微卫星高度不稳定（dMMR/MSI-H）型LARC中显示出高临床完全缓解率，但超过85%的pMMR/MSS型LARC患者无法从单纯免疫治疗中获益。近年来，临床策略聚焦于利用放疗将这些"冷"肿瘤转化为免疫炎症性的"热"肿瘤，再行免疫治疗，已显示出 promising 的疗效。然而，即使经过放化疗联合免疫治疗，部分pMMR/MSS肿瘤仍会产生抵抗。研究人员对热肿瘤中肿瘤特异性CD8⁺ T细胞在ICI治疗前后的动态变化进行了广泛研究，形成了克隆替换和克隆复苏两种主要理论。克隆替换理论认为ICI治疗后肿瘤微环境（TME）中主要是新招募的外周TCR克隆；克隆复苏理论则认为已有肿瘤内T细胞克隆被重新激活，与外周新招募克隆共同发挥抗肿瘤效应。但冷肿瘤中肿瘤特异性CD8⁺ T细胞动态变化与预后的关系尚不清楚。

该研究发表于《Cell Discovery》，研究人员收集了20例接受放疗联合抗PD-1治疗的pMMR/MSS LARC患者的配对肿瘤组织和外周血样本，在治疗前、放疗后和免疫治疗后三个时间点采集肿瘤组织，并在治疗前后采集外周血，进行了scRNA-seq和scTCR-seq分析。此外，研究人员还分析了22例dMMR/MSI-H CRC患者的两个独立队列的scRNA-seq数据以验证发现，并对3例患者进行了全外显子测序（WES），同时整合了已发表的56例LARC放化疗配对WES数据集。研究还纳入2例单纯化疗患者的数据，与29例新辅助化疗直肠癌患者的scRNA-seq数据整合，比较放疗与化疗对肿瘤微环境重塑的差异。

主要技术方法包括：基于10x Genomics平台的scRNA-seq和scTCR-seq、WES、批量RNA-seq、STARTRAC框架分析T细胞克隆动态、Bray-Curtis相似性指数和Morisita指数计算TCR库相似性、TRB k-mer分析CDR3序列特征、Le和Gascuel氨基酸替代模型计算进化距离、Hotspot算法鉴定肿瘤细胞的基因共表达模块、inferCNV推断拷贝数变异（CNV）、扩散映射进行发育轨迹分析、以及小鼠皮下移植瘤模型联合放疗和抗PD-1治疗的体内功能实验。

**研究队列的建立与特征分析**：2018-2019年间，研究人员收集83例LARC患者治疗前肿瘤样本进行批量RNA-seq，发现肿瘤退缩分级（TRG）3级（最差反应）和TRG 0/1级（最佳反应）患者均表现出相似的基线T细胞耗竭评分和MHC-II类抗原呈递评分升高。基于此，研究人员前瞻性纳入2023年1月至2024年8月北京大学人民医院的22例LARC患者，其中20例接受长期术前放疗联合抗PD-1免疫治疗（西米普利单抗），2例接受单纯化疗。20例联合治疗患者中，7例达到完全缓解（CR，TRG 0），15例为部分缓解（PR）。从18例同意采集样本的患者中获得85份配对新鲜样本进行scRNA-seq和scTCR-seq。质控后保留482,289个细胞（238,680个肿瘤组织细胞，243,609个PBMC）。分析显示，CR组和PR组在治疗前肿瘤微环境中免疫细胞比例无显著差异，但PR组外周血中CD4T_MHCII、tTreg_MHCII、CD8T_HAVCR2等激活淋巴细胞亚群富集，提示PR组患者可能存在持续的系统慢性炎症状态。

**基线HLA-DQA2低表达与更好治疗反应相关**：研究人员对髓系细胞进行精细分群，发现治疗前和放疗后CR组与PR组间差异最显著的基因之一为HLA-DQA2，PR组树突状细胞（DC）中HLA-DQA2表达更高。该差异在肿瘤组织和外周血中一致存在，且低表达模式贯穿治疗全程，提示其为患者固有特征而非测序技术因素。在两个dMMR/MSI-H CRC独立队列中验证发现，DC低HLA-DQA2表达患者更可能获得良好疗效。轨迹分析显示成熟DC亚型cDC_LAMP3位于发育轨迹末端，在高HLA-DQA2表达患者治疗前样本中富集；而低表达患者治疗前以未成熟cDC_CD1C为主，放疗后迅速成熟活化，获得正向调控T细胞活化等功能特征。高HLA-DQA2表达可能促进慢性或失调的免疫激活，使肿瘤难以从免疫治疗中获益。

**预先存在的肿瘤浸润CD8⁺ T细胞克隆的持续扩增导致次优治疗反应**：研究人员将CD8⁺ T细胞分为9个亚型，其中CD8T_PDCD1为终末耗竭（Tex）亚型，CD8T_MHCII为高表达MHC-II分子和颗粒酶的高活化亚型。TCR重建显示，CD8T_MHCII克隆多样性最低，提示其为治疗相关显著扩增的活化群体。Tex亚型主要富集于高HLA-DQA2表达组基线样本，而CD8T_MHCII在免疫治疗后主要富集于低表达组。研究人员将共享Tex TCR克隆型的非终末耗竭细胞定义为Tex-Shared（Tex-S）细胞，代表肿瘤反应性CD8⁺ T细胞。免疫治疗后，低HLA-DQA2组Tex-S细胞比例显著增加，超扩增克隆型富集；而高表达组Tex-S比例稳定，Tex细胞减少。TCR k-mer分析显示肿瘤反应性CD8⁺ T细胞富含疏水和带电残基的短k-mer，而旁观者T细胞富集较长k-mer。重要的是，低HLA-DQA2组治疗前后肿瘤反应性CD8⁺ T细胞的Bray-Curtis相似性指数（0.02）和Morisita指数（0.01）均显著低于高表达组，表明低表达组治疗后出现更多新型克隆型。

**来自PBMC的肿瘤反应性CD8⁺ T细胞表现出增强的效应功能**：低HLA-DQA2组治疗后肿瘤反应性CD8⁺ T细胞与PBMC中Tex-S细胞高度相似（Bray-Curtis相似性指数=0.51），而基线相似性几乎为零，表明这些新型克隆主要来源于外周。STARTRAC分析显示，低表达组PBMC来源的Tex-S细胞具有更高的迁移和转化指数。将治疗后肿瘤反应性CD8⁺ T细胞按来源分为预先存在型、PBMC来源型和未知型，发现PBMC来源细胞虽与预先存在细胞耗竭评分相当，但效应评分显著更高。高HLA-DQA2表达组中，免疫治疗后扩增的TCR克隆型主要来源于治疗前已存在于肿瘤内的CD8⁺ T细胞，特别是那些已在慢性炎症状态下部分扩增的克隆，其靶向的肿瘤抗原可能已触发免疫逃逸或亚最优细胞毒性反应，限制了肿瘤清除效果。研究人员将这一现象定义为"克隆陷俘"。

**残留及治疗抵抗性肿瘤细胞GDF15表达升高**：研究人员通过inferCNV和Tumor_score/Normal_score定义肿瘤细胞，发现治疗后残留肿瘤细胞的染色体不稳定性（CIN）水平降低，而基线CIN水平较高的肿瘤更易被清除。Hotspot分析鉴定出17个基因共表达模块，其中Module_13在免疫治疗后成为残留肿瘤细胞的主导模块，富含GDF15和BMP2。细胞间通讯分析显示GDF15与未成熟cDC_CD1C细胞及多个CD8⁺ T细胞亚型存在相互作用。IHC验证显示PR组残留肿瘤细胞GDF15高表达，且在公开数据集的治疗进展过程中稳步升高。

**GDF15抑制CD8⁺ T细胞浸润并降低联合治疗疗效**：研究人员构建了GDF15过表达和敲低的CT26小鼠结直肠癌细胞系，建立皮下移植瘤模型进行长期放疗联合抗PD-1治疗。结果显示GDF15过表达组肿瘤对联合治疗抵抗最显著，而敲低组肿瘤退缩最明显。Transwell迁移实验证实肿瘤来源GDF15抑制CD8⁺ T细胞趋化，IHC显示GDF15过表达组CD8⁺ T细胞浸润显著降低。GDF15敲低细胞在4Gy照射后DNA损伤标志物γ-H2AX表达增加，提示GDF15可能通过维持基因组稳定性促进肿瘤抵抗。公开数据集验证显示，治疗反应最差（TRG 3）的MSS LARC患者基线GDF15表达最高，放疗后残留肿瘤细胞GDF15显著上调。

**放疗有效减少THBS2⁺癌相关成纤维细胞以促进免疫浸润**：研究人员将成纤维细胞分为11个亚型，发现放疗有效减少或消除了与CRC不良预后相关的myCAF_WNT2亚型，其标志基因CTHRC1、WNT2和THBS2表达显著下降。化疗虽减少myCAF_WNT4亚型，但对myCAF_THBS2亚型影响甚微；而放疗对两种亚型均有显著减少作用。放疗还更有效地诱导内皮细胞表达CD74和多种MHC-II分子，促进其转化为非专业抗原呈递细胞，并上调黏附分子MADCAM1和ICAM1促进淋巴细胞浸润。放疗后的CAF主要向表达ADAM28和ADAMDEC1的正常成纤维细胞状态重塑。

**讨论与结论**：该研究将克隆替换和克隆复苏理论扩展至放疗联合免疫治疗领域，并提出"克隆陷俘"概念以解释pMMR/MSS LARC患者中观察到的矛盾现象。在获得CR的患者中，治疗后扩增的CD8⁺ T细胞克隆主要来源于放疗诱导炎症信号招募的新型外周TCR克隆型；而在PR患者中，预先存在的TCR克隆型占主导，这些克隆可能靶向已发生免疫编辑或逃逸的肿瘤抗原。克隆陷俘状态的两大特征为：（1）肿瘤微环境内预先存在的局部免疫炎症，以HLA-DQA2⁺成熟DC和终末耗竭CD8⁺ T细胞富集为标志，与能够呈递肿瘤新抗原的未成熟DC数量有限相关；（2）治疗前PBMC中的慢性免疫炎症环境，与肿瘤反应性CD8⁺ T细胞的迁移和转化潜能降低相关。此外，抵抗性肿瘤细胞分泌的GDF15进一步减少这些细胞向TME的浸润。因此，免疫治疗后的功能恢复主要依赖于肿瘤内预先存在的、已在慢性炎症下部分扩增的TCR克隆型，而非新型的、高效应功能的外周克隆，导致TCR库多样性受限，表现为临床抵抗。

HLA-DQA2在DC中的功能尚未完全明确，该研究发现其在病毒感染和肿瘤免疫中可能发挥不同作用——高表达有利于抗病毒免疫，但在肿瘤背景下可能促进慢性或失调的免疫激活，限制新型肿瘤反应性T细胞克隆的产生和扩增。GDF15作为治疗抵抗的中介分子，靶向其可能为逆转克隆陷俘、提高pMMR/MSS LARC患者放疗联合免疫治疗疗效提供策略。该研究的局限性在于pMMR/MSS LARC患者并非ICI一线适应证，导致联合治疗队列规模受限；同时缺乏靶向GDF15的临床治疗策略评估。