全基因组拷贝数分析发现AKT是胸膜间皮瘤的一种新治疗靶点

《Lung Cancer》：Genome-wide copy number analysis identifies AKT as a novel therapeutic target in pleural mesothelioma

　　

Claudia Kalla|Dina M?nch|Sophia Steinlein|Alessandro Pastore|Heike Horn|Roger Falkenstern-Ge|Julia Schüler|German Ott|Gerhard Preissler

Margarete Fischer-Bosch博士，德国斯图加特临床药理学研究所，邮编70376

摘要

目的

针对胸膜间皮瘤中异常激活的激酶进行治疗是一种很有前景的策略。为找出潜在候选靶点，我们首先分析了胸膜间皮瘤中反复出现的染色体增益现象，进而研究了因基因扩增和/或过度表达而激活的激酶的特异性抑制作用。

方法

我们使用OncoScan技术检测了42例原发性胸膜间皮瘤样本的染色体变异情况，并通过免疫组化方法检测了AKT的表达情况。在细胞系及原代细胞中研究了Ipatasertib（泛AKT抑制剂）和Sapanisertib（mTOR抑制剂）对细胞存活、凋亡诱导、AKT/mTOR信号通路以及糖酵解过程的影响。此外，在经过AKT和mTOR表达检测筛选出的PDX模型中进一步评估了这些药物的抗肿瘤效果。

结果

通过OncoScan分析，我们发现了11个存在显著染色体增益的区域。其中，14q32.33和19q13.2区域的增益影响了AKT1和AKT2，它们都属于AKT丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族。在91例胸膜间皮瘤样本中，66%（60例）存在AKT1表达，80%（73例）存在AKT2表达，94%（86例）存在AKT3表达。有57%的样本同时表达AKT1/AKT2/AKT3。Ipatasertib处理可降低胸膜间皮瘤细胞系的细胞活力并诱导细胞凋亡。在三种细胞系以及两名患者的原代细胞中，Ipatasertib与Sapanisertib联合使用具有协同的细胞毒性作用，即便在顺铂耐药的细胞中也是如此。在PDX模型中，这种联合疗法也展现了更好的治疗效果。从机制上来看，该联合疗法可通过协同方式抑制AKT/mTOR下游信号通路、阻止糖酵解并导致ATP耗尽。

结论

我们的研究表明，胸膜间皮瘤中存在因染色体拷贝数增加及基因表达上调导致的AKT激酶异常激活现象。药物干预抑制AKT和mTOR活性可能是治疗间皮瘤的一种有效策略。

引言

胸膜间皮瘤是一种起源于胸膜间皮细胞的恶性癌症，预后较差。该疾病主要分为三种组织学亚型：上皮样型、双相型和肉瘤样型。无论属于哪种亚型，大多数胸膜间皮瘤在确诊时都已处于晚期，且存在多灶性生长趋势，因此只有少数早期患者才能从手术结合放化疗的治疗方案中受益[1]。长期以来，顺铂联合培美曲塞或拉替曲塞一直是晚期胸膜间皮瘤的标准治疗方案，患者的平均生存期约为1年[2]。然而，这种治疗方案仅对25%-30%的患者有效[3]、[4]。近期，采用免疫检查点抑制剂尼伏鲁单抗加伊匹单抗进行的试验显示，其客观缓解率为40%，且总体生存期优于化疗方案（分别为18.1个月和14.1个月，风险比0.74，95%置信区间为0.62至0.88）[5]、[6]。基于这些结果，一线联合免疫疗法已成为新的标准治疗方案[7]。尽管已有显著进展，但针对无应答患者而言，仍迫切需要新的治疗手段。针对异常激活的信号分子研发的新药物或许能为胸膜间皮瘤的治疗带来新希望。

与其他肿瘤相比，间皮瘤的基因组变异数量相对较少，因此可用于药物开发的靶点也较为缺乏。在胸膜间皮瘤的发病机制中，主要的基因组变异包括肿瘤抑制基因*NF2*、*CDKN2A/B*和*BAP1*的缺失以及功能失活突变，这些突变在相应比例的胸膜间皮瘤病例中分别出现，比例约为40%、75%和25%[8]、[9]、[10]。这些基因参与跨膜信号传导、细胞内信号传递、DNA损伤响应、细胞周期调控以及细胞增殖过程。一旦这些基因的功能受损，就会促进胸膜间皮瘤细胞的增殖和转移。虽然直接恢复*NF2*、*CDKN2A/B*和*BAP1*的功能并不现实，但针对其异常激活的下游效应分子进行干预似乎是一种可行的治疗策略。*NF2*的缺失会导致丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶mTOR异常激活，而mTOR负责调控蛋白质、脂质和核苷酸的合成，以及细胞的增殖、存活和自噬过程[11]、[12]。在临床前模型中，雷帕霉素或其衍生物可通过抑制mTOR来遏制间皮瘤细胞的生长[11]、[13]、[14]，但在临床试验中并未取得预期效果（研究编号NCT00770120、NCT01024946）[15]。

近年来，研究人员致力于寻找异常激活的激酶作为胸膜间皮瘤的靶向治疗靶点。多项研究报道了间皮瘤中受体酪氨酸激酶的表达和激活情况，包括EGFR、MET、IGFR、FGFR1和VEGFR等[16]、[17]、[18]。在体外实验中，抑制VEGFR、FGFR1、MET或EGFR确实能够抑制间皮瘤细胞的生长[16]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]。然而，将激酶抑制剂作为单一药物用于临床治疗的试验结果并不理想。例如，VEGFR抑制剂在胸膜间皮瘤中的作用极为有限，且耐受性较差[22]、[23]；而尽管EGFR在胸膜间皮瘤患者中的表达水平很高，EGFR和MET抑制剂在临床治疗中也并无明显效果（相关研究编号分别为NCT00025207、NCT00039182）[24]、[25]，以及NCT01861301中的MET抑制剂研究。VEGFR、EGFR或MET靶向疗法效果不佳，这引发了这样一个问题：这些激酶是否真的是胸膜间皮瘤发生发展的关键驱动因素？因此，我们采用了全基因组分析方法，利用OncoScan芯片检测DNA拷贝数变化，寻找可能含有适合用于靶向治疗间皮瘤细胞的致癌驱动因子的染色体区域。通过这一方法，我们发现AKT激酶在大多数胸膜间皮瘤病例中均为异常激活的致癌基因，具有重要的治疗价值。通过全面的临床前研究，本研究进一步拓展了此前关于胸膜间皮瘤细胞系中AKT1和AKT3表达情况的认知，同时也有证据表明65%-88%的胸膜间皮瘤患者存在磷酸化的AKT表达[26]、[27]、[28]。此外，我们的数据还证实了特异性抑制AKT在胸膜间皮瘤细胞中的细胞毒性作用[29]、[30]，并指出同时抑制AKT/mTOR通路是一种极具前景的治疗策略。

章节摘录

肿瘤标本

本研究共分析了99例胸膜间皮瘤患者的福尔马林固定石蜡包埋切除标本，其中包括10例肉瘤样型、69例上皮样型以及20例双相型胸膜间皮瘤样本。这些标本的病理诊断由经验丰富的病理学家（G.O.，Sabine Bode-Erdmann）根据2015年世界卫生组织分类标准独立完成。这些患者均于2001年至2013年间在德国斯图加特的罗伯特博世医院接受治疗，所接受的治疗方案为顺铂单药化疗或顺铂联合培美曲塞化疗。

胸膜间皮瘤中的基因组增益会影响AKT基因

为检测染色体拷贝数变异，我们使用了OncoScan CNV检测技术进行了全基因组拷贝数分析。本研究共纳入42例原发性胸膜间皮瘤标本，其中9例为肉瘤样型，33例为上皮样型，这些标本的选择标准是肿瘤细胞占比超过50%，且福尔马林固定石蜡包埋标本的保存时间在15年以内。这样的选择标准有助于减少DNA降解，保持最佳的肿瘤组织与非肿瘤组织比例，从而确保数据的准确性。GISTIC2.0分析结果显示，共有15例样本存在显著的染色体缺失现象，11例样本存在显著的染色体增益现象。

讨论

PI3K/AKT/mTOR信号通路是人类癌症中最常被激活的信号通路之一[41]。该信号通路可调控肿瘤细胞的增殖、存活、代谢、迁移能力以及侵袭能力，进而推动肿瘤的进展和转移[41]、[42]。在本研究中，我们发现AKT丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的三个成员在胸膜间皮瘤中均为异常激活的致癌基因，同时也证明了AKT是治疗胸膜间皮瘤的合适靶点。

AKT

结论

在胸膜间皮瘤中，AKT激酶的三种亚型均因染色体拷贝数增加或基因表达上调而处于异常激活状态。在实验性的胸膜间皮瘤模型中，同时抑制AKT和mTOR的活性可产生协同的抗肿瘤效果，这一策略值得进一步研究，有望成为治疗胸膜间皮瘤的新的靶向治疗手段。

CRediT作者贡献说明

Claudia Kalla：文章撰写——审阅与编辑、文章撰写——初稿撰写、数据可视化、结果验证、项目监督、项目管理、研究方法设计、资金筹集、数据整理、研究概念构思。Dina M?nch：文章撰写——审阅与编辑、文章撰写——初稿撰写、结果验证、研究方法设计、实验研究、数据分析。Sophia Steinlein：文章撰写——审阅与编辑、研究方法设计、实验研究、资金筹集。Alessandro Pastore：文章撰写——审阅与编辑、软件应用、研究方法设计、数据分析。

资金支持

本研究得到了德国斯图加特罗伯特博世基金会的支持（项目编号为704、796和7101）。

利益冲突声明

作者们声明存在以下可能被视为利益冲突的财务利益或个人关系：AP是诺华生物医学研究所的雇员。其余作者均声明不存在利益冲突。

致谢

我们感谢斯图加特罗伯特博世医院的Sabine Bode-Erdmann在病理诊断方面提供的专业帮助，同时也感谢IKP斯图加特机构的Katja Br?utigam在实验技术方面给予的出色支持。