《Methods》：EC-isHCR: A rapid method for in situ hybridization chain reaction in diverse animal samples
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小园康宏|三上恭平|横本顺太|林大成|冈村响|钱清音|星野亮|上山拓海|真木勇也|浅冈美穗|大泽纱纪子|东翔太|岩崎由香W.|林诚|林雄|重信修二|丹羽龙辅|小林悟
日本茨城县筑波市305-8577，筑波大学科学技术研究生院，生命与地球科学专业
摘要
原位杂交链式反应（isHCR）能够在多种样本中，从器官到亚细胞结构的不同空间尺度上可视化RNA。我们之前为果蝇的胚胎和卵巢提出了一种快速检测方法——EC-isHCR。不过，EC-isHCR是否具备传统isHCR的功能，比如在各种样本中进行大范围空间尺度分析，目前尚不清楚。在此，我们证明EC-isHCR能够在多种样本中实现高效的RNA检测，这些样本包括整装果蝇、寄生蜂和蚜虫标本；鳟鱼的石蜡切片；冷冻小鼠切片；以及人类培养细胞。此外，EC-isHCR还能检测RNA的亚细胞定位情况。它能够在果蝇胚胎中展示RNA与相分离凝聚物的关联，还能在HeLa细胞中检测富含突起的mRNA。为进一步提升EC-isHCR的适用性，我们开发了一个自动探针设计工具（
https://github.com/ShuntaYorimoto/hcrkit）。将这一工具与EC-isHCR结合，我们便有了一个快速且功能多样的mRNA可视化框架。该框架有助于降低使用快速isHCR的门槛，从而推动生命科学各领域的研究进展。
引言
原位杂交链式反应（isHCR）是一种改进型的原位杂交（ISH）技术，它能够在从器官到亚细胞结构的不同空间尺度上检测RNA[1]、[2]、[3]。由于能够保留空间信息，isHCR可以揭示不同器官和细胞类型之间RNA表达的差异，为理解基因调控以及特定器官和细胞类型的功能提供重要线索。通过可视化RNA的亚细胞定位，我们可以判断RNA是分布在整个细胞中，还是与其他RNA或蛋白质在特定的亚细胞区域聚集，进而了解细胞内的RNA动态。isHCR具有高对比度以及适用于多种样本类型的优点[1]、[2]，因此是验证分析样本空间尺度上的转录组数据的有效方法[4]。
为提升isHCR的实用性，人们对其进行了多项改进。最广泛使用的是基于第三代isHCR的技术，该技术采用分裂探针[2]。分裂探针会与目标RNA杂交，形成一种称为起始体的局部结构，随后起始体会与荧光标记的发夹状DNA结合，通过杂交链式反应将目标RNA与大量荧光分子连接起来。改良型isHCR是第三代isHCR的改进版本，它使用更短的荧光标记发夹状DNA，以此降低试剂成本，而且这种改良可能有助于提高发夹状DNA在样本中的渗透能力[5]。尽管第三代isHCR和改良型isHCR都具有强大的成像能力，但两种方法都需要3天时间对整装样本进行染色[2]，2天时间对切片样本进行染色[5]，这一时间远远长于其他ISH技术，如RNAscope和单分子RNA荧光原位杂交（smFISH）[6]、[7]。
我们之前开发了碳酸乙烯酯-isHCR（EC-isHCR）这种更快速的isHCR检测方法，该方法将碳酸乙烯酯与更短的发夹状DNA结合使用[8]。碳酸乙烯酯是一种核酸变性剂，它能高效促进杂交反应，相比甲酰胺而言能缩短杂交时间[9]。EC-isHCR将染色时间缩短至一天，能够在整装样本中生成高对比度的多重图像。不过截至目前，EC-isHCR仅被应用于少数果蝇样本，且空间尺度较为有限[8]、[10]，它是否具备传统isHCR的功能，比如在多种样本中进行大范围空间尺度分析，目前仍不清楚。
在此，我们评估了EC-isHCR在多种样本类型中的应用潜力，并分析了用该方法获得的图像的亚细胞分辨率。结果显示，EC-isHCR能够在采用常见固定方法的各类样本中实现高效的RNA检测，这些样本包括整装果蝇、寄生蜂和蚜虫标本；鳟鱼的石蜡切片；冷冻小鼠切片；以及人类培养细胞。EC-isHCR还能在果蝇胚胎中检测到mRNA与核糖核蛋白颗粒这种亚细胞结构的关联，在HeLa细胞中检测到富含突起的mRNA。此外，我们还开发了一个适用于多种物种的自动探针设计工具。将EC-isHCR与该探针设计工具结合，我们就为各类样本和应用场景提供了一个简单快捷的isHCR检测框架。
内容片段
EC-isHCR在多种果蝇整装样本中的应用
我们首先测试了EC-isHCR是否适用于黑腹果蝇幼虫样本。在雌性幼虫的生殖腺中，vasa和traffic jam（tj）mRNA在不同类型的细胞中表达：vasa基因在生殖细胞中表达，而tj基因则在混合型的体细胞间质细胞中表达[4]。与之前的研究结果一致[8]，EC-isHCR成功检测到了这些mRNA（见图1A–C）。接下来，我们在成年果蝇样本中也进行了EC-isHCR检测。在成年黑腹果蝇的中肠中，escargot（esg）mRNA主要在肠道干细胞（ISCs）中表达
讨论
在本研究中，我们证明了EC-isHCR能够在多种样本中检测到mRNA，这些样本包括果蝇、寄生蜂和蚜虫的整装标本；鳟鱼的石蜡切片；冷冻小鼠切片；以及人类培养细胞。我们的结果表明，EC-isHCR适用于通过多种方法制备的各种样本。我们成功地使用了免疫荧光检测中常用的样本处理方法来实施EC-isHCR检测，这说明现有的
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。
致谢
我们感谢京都果蝇种质中心以及KYORIN-Fly果蝇种质中心为我们提供果蝇种源。本研究得到了以下资助支持：日本学术振兴会（JSPS）的科学研究补助金[KAKENHI项目编号：24H02030（SK）、JP23KJ0283（HO）、23?K05778（MA）、23?K26997（MH）以及24H02060（YWI）]，日本医学研究开发机构（AMED）的资助[项目编号：JP24zf0127011（YH）]，还有日本科学
