《Molecular & Cellular Proteomics》：Platelet proteome links metabolism to reactivity in Essential Thrombocythemia
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摘要：真性红细胞增多症（Essential thrombocythemia, ET）是一种骨髓增殖性肿瘤（myeloproliferative neoplasm, MPN），其中JAK2、CALR（Calreticulin，钙网蛋白）及MPL驱动突变与不同的临
摘要：真性红细胞增多症（Essential thrombocythemia, ET）是一种骨髓增殖性肿瘤（myeloproliferative neoplasm, MPN），其中JAK2、CALR（Calreticulin，钙网蛋白）及MPL驱动突变与不同的临床表型相关。研究人员通过质谱（mass spectrometry, MS）分析ET患者血小板蛋白质组并结合功能实验检测血小板活化状态。与健康对照相比，ET血小板在线粒体及代谢相关蛋白（包括三羧酸（tricarboxylic acid, TCA）循环酶水平降低及糖酵解特征相对富集）上呈现丰度改变。乙酰水杨酸（acetylsalicylic acid, ASA/阿司匹林）可降低CALR Type1突变血小板中代谢蛋白丰度，而JAK2 V617F血小板仅在一部分蛋白和样本中呈轻微、异质性的升高。功能实验中，JAK2 V617F血小板聚集反应与健康对照相似或更低；未治疗的CALR Type2血小板CD62P（P-选择素，P-selectin）表达升高，提示其比其它ET亚组处于更活化的表型。上述结果表明ET血小板存在突变相关的蛋白质组及功能差异，并提示代谢状态改变可能参与调控血小板反应活性。
本文解读基于发表于《Molecular & Cellular Proteomics》的研究论文"Platelet proteome links metabolism to reactivity in Essential Thrombocythemia"，由Guerrero-Carre?o X等人完成。
研究背景
真性红细胞增多症（Essential thrombocythemia, ET）是克隆性造血疾病——骨髓增殖性肿瘤（myeloproliferative neoplasm, MPN）的一种，以血小板计数持续升高为特征，患者存在血栓或出血并发症风险。ET主要由JAK2 V617F、CALR（Calreticulin，钙网蛋白）移码突变（Type1：52 bp缺失；Type2：5 bp插入）及MPL W515K/L突变驱动，不同驱动突变与不同血栓/骨髓纤维化风险相关。目前ET患者血小板活化状态的调控机制及其受驱动突变和治疗（如低剂量乙酰水杨酸acetylsalicylic acid, ASA）的影响尚不完全清楚。既往研究表明细胞代谢与血栓形成相关，且人血小板保留蛋白质合成能力及功能性剪接体和mTOR通路调控的翻译功能，可将能量代谢与活化偶联。因此研究人员假设ET血小板存在突变特异的代谢重编程并影响血小板反应活性，通过血小板蛋白质组学联合功能实验进行验证。
主要关键技术方法
研究人员纳入按WHO 2016标准确诊的76例ET患者（JAK2 V617F n=20，CALR Type1 n=17，CALR Type2 n=9，MPL W515K/L n=8，三重阴性triple-negative TN n=22）及36例健康供者（healthy control, CTRL），部分患者接受ASA、羟基脲（hydroxycarbamide, HU）或安归宁（anagrelide, ANG）治疗，健康对照部分服用低剂量ASA 3天。采用两轮液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）——第一轮为数据依赖采集（data-dependent acquisition, DDA）模式，第二轮为数据非依赖采集（data-independent acquisition, DIA）模式结合SP3磁珠酶解处理——分析血小板蛋白质组；Western blot验证三羧酸（tricarboxylic acid, TCA）循环酶、糖酵解酶及活化相关蛋白；流式细胞术检测静息及TRAP-6（Thrombin receptor activating peptide-6）、PMA、胶原刺激后CD62P（P-选择素/P-selectin）、CD63、CD36、Annexin V结合及血小板聚集（flow cytometry-based aggregation, FCA）。统计学使用Perseus、R及GraphPad Prism。
研究结果
Sample size of the study
共纳入76例ET（JAK2 V617F 20例，CALR Type1 17例，CALR Type2 9例，MPL W515K/L 8例，TN 22例）及36例健康对照，详细临床及血液学参数列于表1；大部分患者接受ASA单药或联合细胞减灭治疗。
Round #1 mass spectrometry on ET platelets and healthy controls
对43例血小板样本（各突变亚型及对照）行DDA-MS。无CALR突变体特异性肽段检出，推测突变CALR在血小板中丰度极低易降解。无监督聚类显示ET血小板与健康对照蛋白质谱分离；219个蛋白在ET中显著低丰度（FDR<0.05），涉及止血、血小板活化/聚集/脱颗粒（CD63、GP1BA、GP1BB、VWF、CLEC1B）、细胞应激响应及代谢过程（ENO2、IDH2、IDH3A等）；28个蛋白在ET中高丰度，涉及MAPK活化及泛素相关蛋白（RPS27A、UBA52、UBB、UBC）。限定分析线粒体蛋白亦显示健康对照中ACO2、CS、PKM、IDH1/2等约88个线粒体蛋白丰度高于ET组（除少数ASA治疗的JAK2 V617F及CALR突变样本）。未治疗ET vs ASA-free对照比较仍见活化相关蛋白低丰度，表明差异不依赖于治疗。
Analysis of ASA-treated ET patients
聚焦ASA治疗ET vs 未治疗ET及ASA-free对照。JAK2 V617F ASA治疗后多数检测蛋白（含线粒体代谢PDK1、ACO2、IDH2、CS、SDHA、CYC1、FH及活化相关CD36、GP1BA、PF4等）平均丰度升高但幅度异质；CALR突变ASA治疗后CALR Type1两例中线粒体/代谢酶（COX5B、COX6A1、AGK等）降低，活化相关蛋白无明显变化。提示ASA对ET血小板线粒体代谢有影响且JAK2 V617F与CALR突变反应不同，或与驱动突变等位基因负荷相关。
Round#2 MS on ASA-treated ET and healthy controls platelets only
第二轮DIA-MS聚焦ASA效应，含JAK2 V617F、CALR Type1/2 ET及健康对照（服药前后配对）。ET样本（除CALR Type1 ASA组介于对照间）聚为独立簇。1027个ET共有富集蛋白主要关联代谢（糖酵解、TCA、脂肪酸）、活化及止血。各组ASA前后显著差异蛋白重叠极少（仅7个共同）。CALR Type1 ASA治疗后独特上调202蛋白富集免疫过程，下调573蛋白富集线粒体及核苷酸代谢；JAK2 V617F ASA治疗后独特上调136蛋白富集肌动蛋白聚合化、线粒体ATP合成及氧化磷酸化（oxidative phosphorylation, OXPHOS），下调127蛋白富集免疫应答。ASA使CALR Type1广泛抑制线粒体/代谢蛋白，JAK2 V617F呈轻微升高或稳定——二者对ASA的代谢响应相反且多为基因型特异而非普遍药物效应。
Western blotting on platelet lysates
TCA循环酶（ACO2、CS、OGDH、SDHA/B、COXIV等）及下游酶在ET血小板中总体低于对照，TIM23（线粒体内膜转运酶复合体组分，反映线粒体质量）各组无差异排除线粒体数量剧变。糖酵解限速酶PKM2（pyruvate kinase M2）在ET中较高且JAK2 V617F ASA后进一步升高；PFKP、HK2在健康对照ASA后明显升而在ET中变化小；胞质ATP-柠檬酸裂解酶（ATP-citrate lyase, ACLY）在ET中大幅降低。VWF在ASA后ET及对照均升高（α颗粒未外翻），p38 MAPK磷酸化在ASA-free JAK2 V617F高而ASA处理后消失，CD36胞质水平CALR Type2较高。综上ET血小板整体向糖酵解偏移；ASA提升TCA酶在健康对照明显，JAK2 V617F仅轻微且仍低于对照。
Platelet activation
流式检测活化标志物。FSC（前向散射）及Annexin V/PS暴露比值ET低于对照（提示预活化或激动剂再刺激反应性降低）。静息CD36在未经治CALR Type1高于其它组；未治CALR Type2经PMA/TRAP-6刺激后CD62P（MFI比值）显著高于其它ET及对照，治疗后可降至相似水平；JAK2 V617F CD36及CD62P表达与对照相当。说明CALR突变与JAK2 V617F血小板基础活化状态不同。
Platelet aggregation
流式细胞术微聚集体检测各受体（α2β1、αIIbβ3、GPVI、CLEC-2、VWFR、PAR1）经相应激动剂刺激后聚集曲线下面积（area under the curve, AUC）。除PMA及TRAP-6条件下JAK2 V617F血小板聚集低于对照（未治组同趋势）外，其余激动剂下ET与对照无显著差异。提示JAK2 V617F血小板聚集能力相当或低于正常。
讨论与结论
研究人员发现ET血小板蛋白质组区别于健康对照，活化及线粒体代谢相关蛋白普遍低丰度，伴向糖酵解偏移（TCA酶↓、PKM2↑、ACLY↓↓）。JAK2 V617F与CALR突变血小板对ASA呈现不同代谢蛋白响应——CALR Type1中线粒体/代谢蛋白被ASA抑制，JAK2 V617F中稳定或略升——且CALR Type2未治血小板CD62P更高提示更活化表型，JAK2 V617F聚集反应偏低或相当。TIM23稳定不支持ET血小板线粒体质量显著改变。研究局限含各治疗亚组样本量小及治疗异质性，未直接测代谢功能。结论：ET血小板存在驱动突变相关的蛋白质组及功能差异，代谢重编程（线粒体/TCA功能减弱、糖酵解特征增强）可能是突变特异血小板反应性的潜在调控因素，为未来靶向MPN血小板代谢干预提供方向。
