《Leukemia》：Selective targeting of RSK signaling with PMD-026 suppresses FLT3-activated acute myeloid leukemia while sparing normal hematopoiesis
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急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia, AML）是一种分子异质性显著的侵袭性血液系统恶性肿瘤，其特征为骨髓、外周血及髓外组织中未成熟髓系祖细胞的克隆性扩增。尽管近年来分子分型技术取得进展，但AML的长期预后仍较差，成人5年总生存率仅约3
急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia, AML）是一种分子异质性显著的侵袭性血液系统恶性肿瘤，其特征为骨髓、外周血及髓外组织中未成熟髓系祖细胞的克隆性扩增。尽管近年来分子分型技术取得进展，但AML的长期预后仍较差，成人5年总生存率仅约30%。该预后不良情况在老年患者及合并并发症患者中尤为突出，此类患者占新发病例的大多数，且常因无法耐受强化诱导治疗或异基因造血干细胞（Hematopoietic Stem Cell, HSC）移植而受限。目前AML的标准治疗方案为包含蒽环类药物和阿糖胞苷的强化细胞毒化疗，继之以异基因HSC移植，但这些方法常伴发显著毒性反应，包括细胞减少、感染、心脏毒性及长期器官损伤。此外，即使初始治疗获得缓解，复发仍属常见，这凸显了开发新型有效机制导向疗法以延长疾病控制时间并保留正常造血功能的迫切需求。
AML的经典发病机制涉及多种遗传和表观遗传改变累积导致的增殖、分化和存活调控信号网络的紊乱。大规模测序研究揭示了受体酪氨酸激酶、转录因子、染色质修饰因子及信号通路的体细胞功能异常突变驱动着肿瘤异质性和治疗抵抗。其中，激活FMS样酪氨酸激酶3（FMS-like Tyrosine Kinase 3, FLT3）的内部串联重复（Internal Tandem Duplication, ITD）突变是最具临床可操作性的突变之一，见于15-30%的AML病例，与侵袭性疾病的生物学特征、高复发率及不良生存相关。
FLT3靶向抑制剂的临床开发已改善了前线及复发难治性AML的初始缓解率，但由于获得性耐药的存在，长期临床获益仍然有限。这种耐药往往反映了下游丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase/Extracellular Signal-Regulated Kinase, MAPK/ERK）信号通路的再激活，而非FLT3激酶活性的恢复。这些观察提示，靶向关键通路内整合致癌信号的下游效应分子可能成为更具持续性和生物学合理性的治疗策略。
在此背景下，p90核糖体S6激酶（p90 Ribosomal S6 Kinase, RSK）家族作为AML的下游脆弱性靶点受到关注。RSK家族激酶（即RSK1-4）位于MAPK/ERK信号下游，调控影响细胞周期进程、蛋白质合成、应激适应和存活的转录与翻译程序。这些输出的异常调控与白血病增殖、治疗抵抗和疾病持续存在相关。
临床蛋白质组学数据为RSK在AML中的异常激活提供了有力证据。对483例儿童AML患者白血病细胞进行的反相蛋白质阵列分析显示，与正常CD34阳性造血干祖细胞（Hematopoietic Stem and Progenitor Cell, HSPC）相比，总RSK（RSK1、RSK2和RSK3）及苏氨酸573位点磷酸化RSK水平显著升高。重要的是，RSK磷酸化水平增加与更短的完全缓解持续时间和更差的无事件生存期相关，直接将RSK激活与不良临床结局相关联，并提示RSK是AML中具有临床相关性的治疗靶点。
此外，对公开可用的全基因组规模CRISPR/Cas9依赖性数据集的分析确认RPS6KA1（RSK1）为AML中的选择性功能依赖性基因。实验研究表明，RSK1是跨越不同AML亚型的功能依赖性基因，在FLT3突变AML中依赖性增强，其中RSK1缺失对细胞适应性的损害程度超过FLT3缺失本身。这些数据共同将RSK1定位为白血病发生信号的中心整合因子以及AML中广泛可靶向的脆弱性，而非谱系限制性或突变特异性依赖。
为明确具有治疗相关性的RSK亚型，研究人员检测了AML细胞系、患者原代AML样本及健康对照CD34?骨髓HSC中RSK亚型的表达情况。RT-qPCR分析显示，与健康对照CD34?骨髓HSC相比，大多数AML模型中RSK1/3 mRNA表达升高，RSK2 mRNA表达显著升高，且存在细胞系依赖性变异；而RSK4在AML模型与健康对照间无显著差异，但在HEK293细胞中显著升高，与谱系特异性调控一致。免疫印迹分析证实了AML细胞中RSK1和RSK2蛋白的稳健表达，且存在细胞系特异性差异。这些发现提示RSK1和RSK2为造血富集亚型，在AML中具有功能相关性，支持其作为治疗靶向的优先选择。值得注意的是，FLT3突变AML细胞系Molm13和MV4-11较其他非FLT3突变AML模型表现出显著更高的RSK1表达。
研究人员进一步评估了人脐带血CD34?细胞多谱系分化过程中的RSK调控情况。RSK1在分化初期即升高，并在整个分化过程中维持；而RSK2则随成熟进程逐渐下降，至第8天达显著水平，并在第11天和第14天进一步降低，这与已发表的健康HSPC中RSK家族亚型特异性表达模式分析一致。这些数据表明AML细胞选择性保留并调控RSK1/2表达，与分化阻滞表型相关。
遗传学验证进一步支持RSK1在白血病进展中的非冗余作用。在来源于慢病毒转导HL-60 AML细胞系的免疫缺陷小鼠异种移植模型中，shRNA介导的RSK1表达抑制显著延长了生存期。选择HL60异种移植模型是为了评估RSK1依赖性是否仅限于FLT3突变AML之外更广泛的白血病背景，以支持RSK信号作为更广泛的白血病脆弱性而非基因型限制性依赖。在该模型中，shRNA介导的RSK1敲低较对照shRNA显著将中位生存期从24天延长至41天。尽管终点时残留白血病细胞中shRNA的持续存在未直接评估，但遗传学敲低与正交药理学抑制之间的一致性支持了靶向RSK的效应。
RSK通过磷酸化下游效应分子将MAPK/ERK信号整合为转录和翻译输出，其中包括Y框结合蛋白1（Y-Box Binding Protein 1, YB-1）——一种在AML和乳腺癌中参与致癌翻译的转录后调控因子，以及促进白血病增殖和存活的CREB依赖性转录程序。重要的是，RNA干扰介导的RSK2抑制已被证明可选择性诱导FLT3突变AML模型凋亡，同时保留FLT3野生型细胞，凸显了FLT3突变背景下游致癌信号通路中的增强脆弱性。
基于这一遗传学框架，研究人员评估了泛RSK抑制剂PMD-026的药理学抑制效果。PMD-026在所有AML细胞系和原代AML样本中以剂量依赖性方式抑制细胞活力，半数抑制浓度（Half Maximal Inhibitory Concentration, IC??）值处于低微摩尔至纳摩尔范围。为确定靶向效应，研究人员还使用了结构不同的RSK1和RSK2抑制工具化合物PMD-028作为正交验证。生化激酶谱分析显示，PMD-026和PMD-028均能有效抑制RSK1和RSK2。PMD-028在FLT3突变AML模型中产生了与之相当的对细胞活力的抑制作用和相似的IC??值，支持观察到的对AML细胞的细胞毒性反映的是RSK通路抑制而非化合物特异性脱靶效应的推论。重要的是，PMD-028独立地复现了FLT3突变Molm13和MV4;11细胞的增强敏感性，支持在结构不同的RSK抑制剂中FLT3活化AML的增强敏感性。PMD-026和PMD-028均能抑制RSK磷酸化并抑制下游信号输出，表现为CREB和YB-1磷酸化的降低。尽管PMD-028在两种FLT3突变AML模型中的IC??值更低，但PMD-026在测试条件下对RSK通路输出的功能抑制方面表现出略强的磷酸化抑制效果。PMD-026可能在功能上更有效地降低RSK信号。这种差异可能反映了化合物特异性细胞内靶点结合、抑制剂滞留时间或信号动力学方面的差异，而非不同的靶向生物学。
鉴于蒽环类药物仍然是AML治疗的基石，研究人员评估了RSK抑制与柔红霉素联合应用的潜在协同效应。在MV4;11 FLT3突变AML细胞系中，通过联合指数分析，PMD-026与柔红霉素在多个效应水平表现出协同作用，支持RSK抑制降低凋亡阈值并增强细胞毒疗效的模型。协同研究作为原理验证在代表性FLT3突变模型中进行，未设计用于 establish 组合效应的亚型特异性，有待未来通过更广泛的基因型分层组合研究加以验证。鉴于RSK位于MAPK/ERK信号下游，涉及FLT3或MEK抑制剂的联合方案可能代表这一治疗框架的合理延伸。
通过甲基纤维素集落形成单位（Colony-Forming Unit, CFU）实验，PMD-026显示出选择性的谱系依赖性效应，而非对正常造血的全面抑制。CFU-E和多能CFU-GEMM集落形成得以保留，而BFU-E集落仅在部分浓度下出现轻度减少，CFU-GM集落则表现出更强的剂量依赖性敏感性，尤其在较高浓度时。重要的是，与有效抗白血病活性相关的浓度在很大程度上保留了正常造血祖细胞功能，支持3.44至40.96倍的治疗窗口，以及持续靶向RSK而不全面抑制造血祖细胞功能的可行性。
PMD-026的这一安全性特征与当前FLT3抑制剂（如奎扎替尼）形成鲜明对比，后者通常伴随中性粒细胞减少和QTc延长，使持续给药和联合策略复杂化。现有临床安全性报告显示PMD-026不引起骨髓抑制或QTcF延长，提示靶向FLT3下游RSK可能提供更优的治疗指数，同时规避与受体水平抑制相关的常见耐药机制。值得注意的是，PMD-026在转移性乳腺癌中的首次人体Iifax期数据（NCT04115306）表明，该药可实现持续的靶点结合、有利的药代动力学、生物标志物关联的临床活性及可耐受的安全性特征，为其在RSK依赖性AML中的转化潜力提供了临床机制验证。
急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia, AML）是一种分子异质性显著的侵袭性血液系统恶性肿瘤，其五年生存率长期低下，尤其在老年及合并症患者中预后更差。当前标准治疗依赖强化细胞毒化疗，但毒性强且复发率高，因此亟需开发能够保留正常造血功能的新型机制导向疗法。FLT3（FMS样酪氨酸激酶3）激活突变见于15-30%的AML病例，虽已有靶向抑制剂上市，但获得性耐药问题突出，其机制常涉及下游MAPK/ERK（丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶）信号通路的再激活而非FLT3本身功能恢复，这促使 researchers 探索更下游的分子靶点。
P90核糖体S6激酶（p90 Ribosomal S6 Kinase, RSK）家族位于MAPK/ERK通路下游，通过磷酸化下游效应分子调控转录和翻译程序，影响细胞周期、蛋白质合成及细胞存活。临床蛋白质组学数据显示，RSK在儿童AML中异常激活且与不良预后相关；全基因组CRISPR/Cas9筛选亦确认RSK1为AML的选择性功能依赖性基因，尤其在FLT3突变背景下依赖性增强。研究人员因此假设靶向RSK可能为AML提供一种广泛适用且能规避FLT3抑制剂耐药的新策略。
该研究利用患者来源样本、细胞系模型、基因工程小鼠异种移植模型，结合药理学抑制与遗传学验证手段，系统评估了RSK作为AML治疗靶点的可行性与优效性。样本队列来源包括：多株人AML细胞系（含FLT3突变型Molm13、MV4-11及非FLT3突变型）、原代AML患者样本、健康人CD34?骨髓细胞及脐带血CD34?细胞。
RSK亚型表达分析研究显示，RSK1和RSK2是AML中主要表达的亚型。RT-qPCR分析显示AML细胞系和原代样本中RSK1/3 mRNA中度升高、RSK2 mRNA显著升高，而RSK4无显著变化；免疫印迹证实了RSK1和RSK2蛋白的稳健表达，且FLT3突变细胞系Molm13和MV4-11的RSK1表达显著高于其他模型。正常造血分化过程中，RSK1在CD34?细胞分化初期即升高并持续维持，而RSK2随成熟逐渐下降，提示AML细胞选择性保留RSK1/2与分化阻滞表型相关。
体内遗传学验证研究显示，shRNA介导的RSK1敲低在HL-60 AML异种移植小鼠模型中显著延长中位生存期（24天延长至41天），为RSK1促进白血病进展提供了直接的体内基因组证据。
PMD-026药理学抑制效力研究显示，口服生物可利用的泛RSK抑制剂PMD-026以剂量依赖性方式抑制AML细胞活力，IC??值达低微摩尔至纳摩尔水平；结构不同的RSK抑制剂PMD-028产生相当的细胞活力抑制效果，确认了对FLT3突变模型的增强敏感性。两者均能有效抑制RSK磷酸化及下游CREB、YB-1（Y框结合蛋白1）的磷酸化，证实了靶向RSK通路的药理效应。
联合治疗协同效应研究显示，在MV4;11 FLT3突变细胞中，PMD-026与柔红霉素联合应用呈现协同作用，提示RSK抑制可降低凋亡阈值、增强标准化疗效果。
正常造血保留研究显示，通过甲基纤维素CFU检测，PMD-026对正常造血的影响呈谱系依赖性：CFU-E和多能CFU-GEMM集落形成保留，BFU-E轻度减少，CFU-GM较为敏感，但在有效抗白血病浓度下整体造血功能得以维持，计算治疗窗口为3.44-40.96倍。
临床转化潜力与安全性研究显示，与现有FLT3抑制剂常见的中性粒细胞减少和QTc延长相比，PMD-026不引起骨髓抑制或QTcF延长，且首次人体试验（NCT04115306，转移性乳腺癌）已证实其可持续靶点结合、良好药代动力学及可耐受安全性。
研究总结与结论方面，通过整合大规模患者蛋白质组学、功能基因组依赖性数据、亚型特异性表达分析、体内遗传学验证及药理学抑制实验，该研究确立了RSK1和RSK2信号通路为AML中广泛可靶向的脆弱性，且在FLT3活化疾病中存在增强敏感性的证据。PMD-026展现出强效抗白血病活性、与标准化疗的协同效应、对正常造血祖细胞的选择性保留及优越的安全性特征，支持将持续RSK抑制作为改善AML患者预后的机制导向治疗策略进行临床评估。PMD-028的平行活性进一步 corroborates 靶向抑制的生物学 interpretation，增强了研究发现的可靠性。
