靶向端粒DNA损伤应答（telomeric DNA damage response, tDDR）的治疗性抑制挽救由端粒缩短和衰老驱动的造血功能障碍

《Nature Aging》：Therapeutic inhibition of telomeric DNA damage response rescues hematopoietic dysfunction driven by telomere shortening and aging

　　

端粒随衰老进行性缩短并累积损伤，导致细胞衰老及造血功能障碍。研究人员此前发现端粒功能异常诱导端粒非编码RNA（telomeric noncoding RNA, tncRNA）的合成，而tncRNA是激活端粒DNA损伤应答（telomeric DNA damage response, tDDR）——即衰老和炎症的驱动因素——所必需的。然而tDDR是否因果性地损害造血功能尚不清楚。本研究在模拟端粒驱动造血功能障碍及衰老的端粒酶缺陷Terc?/?小鼠中发现，用端粒反义寡核苷酸（telomeric antisense oligonucleotide, tASO）靶向tncRNA可在造血器官中抑制tDDR，减少衰老与炎症，缓解造血功能障碍，并在体内增强造血干细胞（hematopoietic stem cell, HSC）适应性及再植潜力。上述观察在老年野生型小鼠中得到重现，且tASO体外处理可改善老年供者来源人HSC的功能。综上，结果确定tDDR是造血衰退的致病驱动因子，并支持以tASO介导的tDDR抑制作为端粒生物学疾病（telomere biology disorders, TBDs）及年龄相关性造血衰老的潜在治疗策略。

论文解读——《Therapeutic inhibition of telomeric DNA damage response rescues hematopoietic dysfunction driven by telomere shortening and aging》（Nature Aging）

一、研究背景与立项依据

端粒（telomere）是位于线性染色体末端的TTAGGG重复序列及相关蛋白复合物，保护染色体末端并维持基因组稳定性。由于末端复制问题及核酸酶降解，端粒随每次细胞分裂渐进性缩短，达到临界短小时后被识别为DNA损伤，触发端粒DNA损伤应答（telomeric DNA damage response, tDDR），其特征包括组蛋白H2AX第139位丝氨酸磷酸化〔γH2AX（phospho-H2AX Ser139）〕及磷酸化KRAB关联蛋白1〔pKAP1（phosphorylated KAP1）〕等在端粒位点募集。持续活化的tDDR驱动细胞周期停滞即细胞衰老（cellular senescence），并分泌促炎因子形成衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP），引起慢性炎症及微环境紊乱。造血系统对端粒缩短尤为敏感，造血干细胞和祖细胞（hematopoietic stem and progenitor cell, HSPC）端粒耗竭导致HSPC耗竭、血细胞生成减少及免疫失调，是端粒生物学疾病（telomere biology disorder, TBD，如先天性角化不良 dyskeratosis congenita, DC）及生理性造血衰老的核心特征。既往研究发现功能异常端粒双向转录产生端粒非编码RNA（telomeric noncoding RNA, tncRNA），tncRNA通过液-液相分离促进DDR因子在损伤端粒处募集并维持tDDR信号；序列特异性端粒反义寡核苷酸（telomeric antisense oligonucleotide, tASO）可结合并阻断tncRNA功能从而选择性抑制tDDR而不影响非端粒DNA损伤应答。然而tDDR是否因果参与造血功能障碍、以及靶向tDDR能否逆转造血衰退尚未阐明。本研究利用Terc^?/?（端粒酶RNA组分缺失）第三代（G3）小鼠模拟TBD及加速衰老表型，系统评估tASO抑制tDDR对造血系统的修复作用及其在正常衰老模型和人原代细胞中的适用性。

二、主要技术方法概述

研究采用G3 Terc^?/?小鼠及同龄/老年C57BL/6J野生型（wild-type, WT）小鼠为体内模型，部分实验使用CD45.1/CD45.2同种异体竞争性骨髓移植（competitive BM transplant）受体鼠。tASO（抗G链 anti-TeloG、抗C链 anti-TeloC及对照无关序列ASO）经腹腔注射给药。人样本取自健康老年男性供者骨髓纯化CD34⁺HSPC行体外tASO处理。主要技术手段包括：流式细胞术检测HSPC表面标志及胞内γH2AX、pKAP1、Cdkn2A/p16^INK4a、Ki67；免疫荧光联合端粒FISH（immunoFISH）鉴定端粒功能障碍诱导灶（telomere dysfunction-induced focus, TIF）；骨髓/脾脏H&E及免疫组化（IHC：PAX5、IBA1、MPO、CD41、TER119）；集落形成单位（colony-forming unit, CFU）实验评估HSPC体外克隆潜能；竞争性骨髓移植评估体内再植（repopulation）能力；多重细胞因子免疫检测；qPCR检测相对端粒长度及Cdkn2A/p16 mRNA；Western blot检测γH2AX；SARS-CoV-2 mRNA疫苗激发后血清抗Spike IgG ELISA评价体液免疫应答。统计学采用单因素/双因素ANOVA加Tukey多重比较或Student t检验。

三、研究结果

tASO effectively inhibits tDDR in the hematopoietic organs of Terc^?/?mice（tASO有效抑制Terc^?/?小鼠造血器官中tDDR）

对年轻G3 Terc^?/?小鼠给予tASO腹腔注射，流式细胞术显示Terc^?/?对照组骨髓及脾脏γH2AX^high、pKAP1^high及双阳性细胞比例较WT升高，tASO处理显著降低该比例；immunoFISH证实TIF数目在Terc^?/?升高而tASO处理后明显减少；端粒-FISH显示tASO不改变端粒长度；电离辐射诱导的非特异性DDR不被tASO影响，证明tASO选择性抑制tDDR且不干扰全基因组DDR。各造血细胞亚群（B细胞、髓系细胞等）均显示tDDR被tASO抑制。

tDDR inhibition by tASO treatment leads to reduced senescence burden and diminished inflammation in hematopoietic organs of Terc^?/?mice（tASO抑制tDDR降低Terc^?/?小鼠造血器官衰老负荷与炎症）

Terc^?/?对照骨髓及脾脏Cdkn2A/p16^high细胞比例高于WT，tASO处理显著下调；骨髓液中IL-6、IFNγ、TNFα及血浆IL-17A在Terc^?/?升高，tASO处理后降低，表明tDDR抑制减轻细胞衰老及相关炎症。

tDDR inhibition contrasts progressive immune system dysfunction of older Terc^?/?mice（tDDR抑制改善成年Terc^?/?小鼠进行性免疫系统功能障碍）

成年（12月龄）Terc^?/?小鼠骨髓红系集落减少、髓系（尤其未成熟髓系）扩张、巨核细胞多形性及脾白髓萎缩/红髓增生伴髓外造血，病理评分升高；tASO长期处理使骨髓和脾脏组织学病理评分显著下降，PAX5⁺B细胞恢复，MPO⁺粒细胞及CD41⁺巨核细胞/血小板区恢复正常，TER119⁺红细胞分布正常化。tASO处理组体重轨迹改善，无脾肿大或外周血毒性征象，长期给药安全。疫苗实验显示tASO处理年轻Terc^?/?小鼠SARS-CoV-2 spike特异IgG高于对照，提示早期体液免疫增强。

tDDR inhibition enhances Terc^?/?HSPC fitness（tDDR抑制增强Terc^?/?HSPC适应性）

Terc^?/?对照LSK（LIN^?Sca-1⁺c-Kit⁺）区γH2AX^highpKAP1^high及p16^high比例升高，tASO将其恢复至WT水平；LT-HSC（long-term HSC, CD135^?CD34^?）中Ki67^low（静息）比例在Terc^?/?降低、Ki67^high升高（代偿性增殖），tASO恢复静息/增殖平衡，主要作用于LT-及ST-HSC而非下游多能祖细胞（multipotent progenitor, MPP）。CFU实验显示Terc^?/?骨髓克隆形成能力下降，tASO体内或体外直接处理均恢复克隆数，证明为细胞自主效应。老年Terc^?/?小鼠同样显示tASO改善CFU能力。

tDDR inhibition improves in vivo HSPC reconstitution ability of Terc^?/?mice（tDDR抑制改善Terc^?/?小鼠HSPC体内再植能力）

竞争性骨髓移植中，Terc^?/?供体细胞的外周血及LSK区再植比例低于WT供体；经anti-TeloG tASO处理的Terc^?/?供体细胞再植能力恢复至WT水平，且对各谱系体细胞（B、T、髓系）贡献均衡，证明tDDR抑制增强HSC体内竞争重建功能。

tDDR inhibition ameliorates age-associated hematopoietic decline in physiologically aged mice（tDDR抑制改善生理衰老小鼠年龄相关性造血衰退）

15–16月龄WT小鼠给予tASO后，骨髓γH2AX^highpKAP1^high细胞及Cdkn2A/p16 mRNA较未处理老年鼠降低；LSK内DDR信号下降；CFU克隆数较老年对照增加；疫苗后抗Spike IgG高于老年对照。人原代CD34⁺HSPC（老年供者）体外tASO处理CFU集落（红系+髓系）较对照增多。表明tDDR抑制在生理性衰老小鼠及人标本中同样改善HSPC功能与免疫应答。

四、讨论与结论（翻译浓缩）

本研究证明tDDR是端粒缩短背景下造血功能障碍的致病驱动因子。利用tASO靶向tncRNA可在体内选择性抑制tDDR、降低细胞衰老与炎症、恢复HSPC静息态及再植能力、纠正造血细胞组成异常并改善免疫应答，且不改变端粒长度亦不影响全基因组DDR，在Terc^?/?小鼠、生理衰老WT小鼠及人老年HSPC中均有效。该策略区别于端粒延长疗法，适用于多种病因（遗传性TBD突变、氧化/代谢应激等）导致的端粒功能异常，为端粒生物学疾病（如DC相关骨髓衰竭）及年龄相关性造血衰退提供了潜在治疗方向。局限包括下游通路互作需单细胞解析、anti-TeloG与anti-TeloC体内效果差异机制待明、人原代细胞样本量较小需扩大验证。综上，tDDR抑制是以tASO为代表的可行干预靶点，可解耦端粒结构异常与功能性损伤，具转化前景。