《Nature Biomedical Engineering》：Derivation of functional retinal endothelial cells from human pluripotent stem cells for therapeutics and modelling
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视网膜微血管疾病涉及内血-视网膜屏障(inner blood-retina barrier, iBRB)的损伤，其机制目前尚不完全清楚。因此，获得可再生的人源iBRB内皮细胞来源对于推进眼科研究和治疗开发至关重要。本研究通过Wnt-β-catenin通路（即N
视网膜微血管疾病涉及内血-视网膜屏障(inner blood-retina barrier, iBRB)的损伤，其机制目前尚不完全清楚。因此，获得可再生的人源iBRB内皮细胞来源对于推进眼科研究和治疗开发至关重要。本研究通过Wnt-β-catenin通路（即Norrin-Frizzled4信号）将人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells, hiPSCs)分化为视网膜内皮细胞(retinal endothelial cells, iRECs)。这些iRECs展现了基因、蛋白和功能层面的保真度以及独特的视网膜特征。当注射到氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy, OIR)小鼠体内时，iRECs整合到宿主血管网络中，并使缺血眼重新血管化，从而挽救了组织损伤。在微生理模型中，iRECs形成了可灌注的微血管网络，重现了健康和糖尿病状态下的iBRB形态与表型，同时还能在生理状态下与hiPSC来源的视网膜周细胞(retinal pericytes, iRPCs)进行组织互动。本研究建立了功能性人源iRECs及微生理iBRB模型，有助于旨在识别治疗靶点并促进受损视网膜血管再生的机制研究，从而支持治疗方法的进步。
研究背景与意义
视网膜组织因神经元活动剧烈，是全身耗氧耗能最高的组织，这使其极度依赖内血-视网膜屏障(iBRB)来维持眼内稳态。iBRB由位于中枢神经系统内部视网膜层内的血管系统构成，其中的视网膜内皮细胞(Retinal Endothelial Cells, RECs)通过形成紧密连接来调节小分子扩散。iBRB的发育与维持受Wnt-β-catenin通路（特别是Norrin-Frizzled4, Fz4轴）的严格调控。然而，iBRB功能障碍是众多视网膜微血管疾病的标志，其中糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopathy, DR)最为典型。长期高血糖导致的内皮屏障通透性增加和氧气输送减少会引发缺血，进而导致出血、视网膜脱落甚至不可逆的失明。尽管iBRB破坏的临床影响广泛，科学界对其病理机制的理解依然有限，严重制约了治疗方案的开发。此外，原代人类RECs在体外培养中极易失去其体内特异性表型，且缺乏组织特异性的内皮细胞模型。因此，开发具有生物保真度的可再生人源RECs对于疾病建模和细胞治疗具有迫切的必要性。该研究发表在《Nature Biomedical Engineering》，旨在通过干细胞技术解决这一难题。
关键技术方法
研究人员主要采用hiPSC定向分化技术，通过电穿孔递送化学修饰的ETV2信使RNA以高效诱导内皮细胞命运。为了赋予细胞视网膜特异性，研究在分化过程中引入了Norrin和Vitronectin以激活Norrin-Fz4轴，并使用RepSox（一种TGFβ-ALK5抑制剂及Notch和Wnt信号激活剂）促进屏障成熟。随后，通过磁激活细胞分选(MACS)技术进行CD31和Fz4的双阳性分选以获得高纯度的iRECs。为了评估功能，研究采用了跨内皮电阻(TEER)检测、通透性分析、葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)摄取实验以及P-糖蛋白(P-gp)外流实验。在疾病建模方面，研究构建了三维胶原水凝胶模型和微流控iBRB-on-a-chip模型，并结合缺氧与高糖处理模拟DR环境。体内疗效则通过氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠模型进行评估，利用玻璃体腔内注射观察血管再生情况。最后，通过大量RNA测序(RNA-Seq)分析了转录组特征。
研究结果
通过Norrin-Fz4轴从人诱导多能干细胞衍生视网膜内皮细胞
研究人员成功建立了基于ETV2 mRNA电穿孔的高效分化流程。关键发现在于，Norrin和Vitronectin的加入显著激活了Wnt-β-catenin信号通路，诱导了Fz4受体的内吞作用，这是iREC特化的关键步骤。通过CD31和Fz4的双轮磁珠分选，研究人员获得了高纯度的iRECs群体。这些细胞不仅表达了CD31、VE-Cadherin等经典内皮标志物，还特异性高表达紧密连接蛋白Claudin-2、Occludin以及屏障成熟因子RepSox，且在早期传代中保持了稳定的表型。
iRECs重现健康与糖尿病视网膜病变iBRB的功能与网络特征
功能验证显示，iRECs展现出比非组织特异性内皮细胞(iECs)更高的跨内皮电阻(TEER)值和更低的渗透性，证明其具有更强的屏障功能。在转运功能方面，iRECs表现出显著的GLUT1介导的葡萄糖摄取能力和功能性P-gp外流泵活性。在三维培养中，iRECs能够自组装形成具有管腔结构的毛细血管样网络。更为重要的是，在模拟DR的缺氧与高糖环境下，iRECs的紧密连接蛋白发生错位，TEER值显著下降，血管网络出现退化、管腔断裂及糖萼降解，精准重现了DR早期的临床病理特征，而普通iECs对此环境变化不敏感。
iRECs的转录组分析揭示其对REC基因型的独特重现
转录组分析表明，iRECs与iECs在基因表达上存在显著差异。iRECs特异性上调了FZD4、IGF2、CLDN10、CLDN23等视网膜特异性基因，以及基底膜成分（如COL4A1、LAMA1）和Wnt信号通路相关基因。通过与已发表的原代人类RECs及脑内皮细胞数据集对比，证实iRECs具有独特的视网膜转录谱，而非简单的脑内皮细胞替代物，这为其在视网膜研究中的应用提供了基因组学依据。
iRECs使缺血眼重新血管化
在OIR小鼠模型中，移植的iRECs能够整合到宿主血管系统中，特别是在缺氧的无血管区域形成了具有管腔的人类-小鼠杂交血管网络。这种整合显著减少了病理性新生血管(NV)和血管闭塞(VO)面积，并使宿主血管的节段体积和管径恢复到接近健康小鼠的水平。此外，iREC治疗组的视网膜血管通透性显著降低，证明了其在体内的修复功能和屏障重建能力。
iPSC衍生的iBRB-on-a-chip
研究人员进一步构建了包含iRECs和hiPSC衍生的视网膜周细胞(iRPCs)的微流控芯片模型。iRPCs同样通过Norrin诱导分化获得，并在长期传代中稳定表达Fz4和PDGFRβ。在该芯片模型中，iRPCs生理性包裹并支持iREC网络，两者的相互作用不仅优化了血管网络的形态（减小了分支长度和管腔直径以匹配体内毛细血管尺寸），还显著降低了网络的渗透性，达到了接近体内水平的屏障完整性，成功模拟了复杂的神经血管单元结构。
讨论与结论
本研究成功通过靶向Norrin-Fz4信号通路，从hiPSCs中分化出了具有高保真度的功能性视网膜内皮细胞(iRECs)。这些细胞不仅在分子和功能上模拟了天然RECs，还能在三维环境中响应疾病刺激，并在动物模型中实现组织修复。研究建立的iBRB-on-a-chip平台整合了内皮细胞与周细胞，为研究视网膜微血管动力学及药物筛选提供了前所未有的生理相关性模型。尽管原代细胞标记物的发现和完全模拟体内微环境的复杂性仍是挑战，但这项研究为理解iBRB发育、病理机制以及开发针对视网膜微血管疾病的精准疗法开辟了新途径。
