《Nature Neuroscience》：Connectomic evidence that ordered activity drives neuromuscular network formation
编辑推荐：
研究人员重建了小鼠小肌肉从出生到出生后发育连续阶段（此时突触重组最为显著）运动神经元与肌纤维之间的完整连接组。在发育过程中，轴突分支的显著减少导致每个神经肌肉接头（Neuromuscular Junction， NMJ）的轴突数量减少了约6.5倍，最终所有NM
研究人员重建了小鼠小肌肉从出生到出生后发育连续阶段（此时突触重组最为显著）运动神经元与肌纤维之间的完整连接组。在发育过程中，轴突分支的显著减少导致每个神经肌肉接头（Neuromuscular Junction， NMJ）的轴突数量减少了约6.5倍，最终所有NMJ均实现单一神经支配。令人惊讶的是，许多新生肌纤维也拥有不止一个NMJ位点。这些额外的NMJ大多数（但非全部）被消除。成年后残存的少数多NMJ肌纤维拥有两个相距甚远的接头，由施加相似收缩力（因此具有相似活动模式）的轴突支配。出乎意料的是，肌肉连接组进一步表明，无论是单个NMJ的轴突丢失，还是整个NMJ的消除，都与支配轴突群的募集顺序有关，并且这种关系反映了轴突共支配的等级排序模式。这些观察结果认为，局部的接头内和长距离的接头间突触竞争都是活动介导的，并且成熟神经回路的结构源于发育中回路的活动模式。
### 基于连接组学的神经肌肉发育突触重组研究解读
#### 研究背景与意义
哺乳动物神经系统在出生后能够根据动物经验进行适应性调整，这体现在从笨拙到协调运动的转变，以及感觉和自主系统的广泛修饰中。神经回路中突触的增加和消除在发育动物中普遍存在，可能介导了这种行为改变。然而，感觉经验和运动实践如何塑造神经回路仍知之甚少。出生后突触重组在发育中的哺乳动物外周神经系统中得到了广泛研究。在新生啮齿动物中，多个α运动神经元发出轴突分支支配同一个神经肌肉接头（NMJ）。除一条轴突外，其他轴突最终都会撤回，使每个成年NMJ仅保留一个运动输入。这种突触消除是由基于电活动的神经元间对突触领地的竞争驱动的，但活动如何决定突触的命运尚不清楚。本研究以此为出发点，旨在探究突触命运的决定因素，通过生成轴突与其突触后靶点在整个重组阶段的完整接线图（即连接组）。这项研究发表在《Nature Neuroscience》上，其重要意义在于揭示了两种并发的突触消除形式，并提出了一个由模式化活动驱动的统一原理来解释神经肌肉连接组的精细化过程。
#### 关键技术方法
研究人员综合运用了多种前沿技术。首先，利用连续切片电子显微镜（ssEM）和共聚焦显微镜技术，在不同发育阶段（从新生到成年）对小鼠耳部肌肉（如耳间肌）进行了完整的连接组重建。其次，为了在发育中期（P6-P9）可视化多神经元支配，研究使用了膜靶向的Brainbow转基因小鼠模型，该模型通过膜锚定荧光蛋白实现了运动轴突的多色标记，从而能够清晰分辨支配同一NMJ的不同轴突。此外，研究还采用了α-银环蛇毒素（α-bungarotoxin）染色标记NMJ的乙酰胆碱受体，并通过图像采集、拼接、对齐及半自动/手动注释流程，对肌肉纤维、轴突、NMJ进行了详尽的语义和实例分割。统计分析方面，通过构建零模型（如配置模型）进行蒙特卡洛模拟，比较观察到的连接模式与随机连接的差异，以评估其有序性的统计显著性。
#### 研究结果
**1. 基于推定收缩力对运动轴突进行排序**
在成年小鼠耳间肌中，研究人员重建了所有运动轴突的树突和肌纤维靶点。通过测量肌纤维横截面积（CSA，作为其收缩强度的相关指标）并估算每个运动单位（由单个运动神经元支配的所有肌纤维）的总CSA（作为其产生的总收缩力的代理），发现运动单位的总CSA存在约50倍的差异。这与运动轴突按收缩力从小到大固定顺序募集的亨内曼大小原则一致。连接组学结果表明，运动单位大小可能低估了运动单位收缩力的范围，因此总CSA可能比运动单位大小更准确地预测运动单位募集时间。
**2. 肌纤维有时拥有不止一个NMJ**
连接组重建揭示，成年小鼠耳间肌中有一小部分肌纤维（5.5%-7.4%）拥有两个NMJ（称为多终板肌纤维， MEFs），其余为单终板肌纤维（SEFs）。每个MEF上的两个NMJ之间的距离显著大于随机预期。有趣的是，支配同一MEF的运动单位对的估算收缩力（或运动单位大小）比随机预期更为相似，并且相同的运动单位对反复共同支配相同的MEFs。根据亨内曼大小原则，这暗示这些轴突在募集顺序上彼此接近，因此具有相似的活动模式。
**3. 发育过程中的NMJ消除及其距离依赖性**
对发育系列肌肉的调查发现，MEFs在出生时比成年期平均多4.8倍，数量在出生后头两周急剧下降。新生期不仅MEFs更多，而且它们的NMJ平均距离更近。NMJ的丢失强烈依赖于接头间距离，但距离是必要而非充分因素。在P10-P12肌肉中发现的少数几个具有邻近NMJ的MEFs，均由同一轴突支配两个接头。此外，与SEFs相比，MEFs上的接头内突触消除加速。
**4. 长距离突触间竞争的活动介导机制**
研究人员提出了一个模型来解释NMJ的消除与维持：当同一肌纤维上两个NMJ的突触后动作电位（APs）异步发生时，来自一个接头的AP会侵入由另一轴突支配的远处接头并使其失稳，导致后者消除。反之，当两个NMJ引发的APs相对同步时，它们会发生碰撞和湮灭，从而允许两个接头共存。模型预测，AP碰撞的概率取决于接头间距离和轴突活动的相对同步性。这解释了为什么成年MEFs的两个NMJ必须相距甚远才能共存，以及为什么即使同一轴突支配两个邻近NMJ，其中一个也终将被消除。
**5. 发育中神经肌肉连接组的全网络等级排序**
利用Brainbow技术对P6-P9肌肉连接组的研究发现，所有共同支配同一NMJ的轴突子集遵循一致的非随机排序规则。这种等级排序表现为，运动神经元与其在顺序中的紧邻共享最多的NMJ，而与较远的轴突共享较少。这种模式不能用简单的化学特异性（如肌纤维类型匹配）来解释。相反，它可能与轴突在NMJ的相对同步性有关，即募集顺序相邻（更同步）的轴突比异步活动的轴突能在同一NMJ共存更长时间。研究还发现，最小的运动单位可能位于等级顺序的两端，这与它们可能参与异步的、循环的“运动单位轮换”活动模式相符。
**6. 出生时大规模的突触汇聚和发散**
新生连接组显示，所有肌纤维都由多于一条轴突支配，所有NMJ（99.7%）均为多神经支配，平均有6.53条轴突汇聚到每个NMJ。此外，34.4%的新生肌纤维拥有多于一个NMJ。这种高汇聚性使得单个肌纤维可以接受来自多达75%的运动神经元的支配。出生后，每个NMJ的轴突数量和每根肌纤维的NMJ数量都大幅减少。尽管新生连接组非常密集，但已显示出与后期相似的等级排序连接模式的雏形，并且运动单位大小与肌纤维直径之间已存在相关性，表明大小原则在出生时已开始显现。
#### 讨论与结论
本研究通过连接组学方法，揭示了小鼠出生后神经肌肉连接重组的多方面现象，包括超出预期的回路重塑程度、整个NMJ的竞争性消除、连接性的等级排序、在同一肌纤维上维持多个NMJ所需的距离条件，以及突触重组程序可能始于产前早期。研究人员认为，这些发现都可以用模式化活动驱动的突触消除这一统一原理来解释。
**NMJ的丢失和维持由突触间活动的时间决定**：除了向单神经支配NMJ的转变，拥有多个NMJ的肌纤维数量也减少了约80%。通常，在出生后早期，异步的神经活动允许来自一个NMJ的AP侵入由另一轴突支配的突触位点，导致后者的破坏。只有当不同接头引发的突触后活动时间相似，允许它们的APs发生碰撞时，MEFs才能长期维持。这种机制解释了为什么两个NMJ只有在相距很远时才能持续存在。MEFs上轴突撤回的加速速率也支持活动从一NMJ驱动另一NMJ消除的观点。此外，成年MEFs中剩余的连接性等级排序模式与发育中多神经支配NMJ的模式相似，支持了NMJ丢失和接头内突触消除由相同模式化活动依赖过程驱动的观点。
**突触连接的等级排序是轴突活动等级排序的结果**：支配MEFs上两个位点的轴突在募集顺序上应彼此接近。如果同一轴突支配多个MEFs，则可能形成一个近似募集顺序的连续网络。在发育中期的肌肉中，所有被调查肌肉都发现了这种连续网络模式，其中神经元与其紧邻共享最多的接头。研究人员将这种无间隙的连接性解释为与上述模式化活动依赖原理一致，即对于接头间和接头内连接性，当其活动模式与同一肌纤维上的主流活动模式紧密匹配时，突触释放位点的维持时间最长（可能是永久性的）。连接组重建揭示了运动轴突的等级排序排列，研究人员将其归因于运动单位在募集顺序中的位置。有趣的是，在成年和发育连接组中，都可以通过不止一条路径遍历此募集顺序并汇聚到最大的、最后募集的单位。这提示肌肉中可能存在多种募集模式，例如通过运动单位的“轮换”来缓解疲劳。
**发育重排与突触消除的三种不同结局**：与突触消除相关的发育重排可能出现三种不同结局。最大的运动单位（最后募集）在NMJ内的突触消除中似乎具有优势（因此它成为最大的运动单位），但最先募集的轴突在接头间竞争中具有优势。对于为何最后募集的轴突能在竞争中胜出，先前分析表明神经元的总突触资源有限，并且单个突触的神经递质释放量受到运动单位大小和释放频率的不利影响。在成年期，所有运动单位都针对有效的突触进行了优化，这意味着大型运动单位必须相对不频繁地放电以避免资源耗尽，而高活性的运动单位必须相对较小以维持其释放特性。
**产前活动的作用**：研究结果表明，尽管出生时接线图非常复杂，但这一早期连接组已经预示了成年连接模式。这种出生后的早期模式化可能是产前运动活动启动修剪过程的结果。然而，新生连接组的持续精细化不可能是随机突触消除的结果，这在发育一周时的结构化连接性中表现得很明显。模拟表明，无法通过从新生模式随机修剪连接来预测成年模式。因此，出生后生活中的选择性突触消除机制必须在建立用于肌肉张力分级募集的特定运动单位大小方面发挥核心作用。
**募集顺序在神经回路中的普遍作用**：在运动系统中，肌肉纤维收缩期间神经元活动的有序募集是肌肉动作的核心特征。基于本研究结果，研究人员推断，这一特性在发育过程中通过每个肌纤维所经历的神经元活动逐渐同质化而出现，这是由于汇聚到同一肌纤维的神经元之间的募集时间差异通过修剪活动异常值而逐渐变小。类似的等级排序连接模式也出现在其他神经系统部分（如交感神经系统），表明活动募集波可能是这些不同神经系统部分相似连接模式的基础。对连接组结构的详细分析可能为了解产生它的活动模式提供见解，从而提供确定先前经验物理印迹的方法。
**结论**：综上所述，本连接组学研究揭示了神经肌肉连接在出生后发育中经历的大规模、有序的重塑过程。研究结果表明，无论是局部接头内的轴突竞争，还是长距离接头间的整个NMJ消除，都受到支配轴突活动模式（特别是其相对同步性与募集顺序）的深刻影响。一个基于动作电位碰撞与入侵的模型成功地解释了多NMJ肌纤维的存留条件及其距离依赖性。发育中连接组呈现出的等级排序网络结构，很可能是由运动单位按大小原则有序募集所衍生的活动模式印迹。这些发现共同支持了一个核心观点：成熟神经回路的结构源于发育中回路特定的、模式化的电活动，活动依赖的竞争与消除机制共同塑造了最终的神经肌肉接线图。
