《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Tetrahedral DNA nano-PROTACs enable enhanced ocular penetration and efficient nucleolin degradation for choroidal neovascularization therapy
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尽管抗血管内皮生长因子（VEGF）疗法为治疗新生血管性年龄相关性黄斑变性带来了范式转变，但重大挑战仍然存在，包括频繁玻璃体内注射带来的眼内感染和视网膜结构损伤风险、部分患者长期疗效欠佳，以及经济和心理负担。因此，需要探索具有更顺应性给药策略的新型治疗靶点。本研
尽管抗血管内皮生长因子（VEGF）疗法为治疗新生血管性年龄相关性黄斑变性带来了范式转变，但重大挑战仍然存在，包括频繁玻璃体内注射带来的眼内感染和视网膜结构损伤风险、部分患者长期疗效欠佳，以及经济和心理负担。因此，需要探索具有更顺应性给药策略的新型治疗靶点。本研究中，研究人员发现核仁素（Nucleolin， NCL）在脉络膜新生血管（CNV）病变中表达上调，并在VEGF刺激下易位至内皮细胞表面。受此定位变化及NCL在血管生成中关键作用的启发，研究人员开发了一种集成的递送与降解平台，命名为dNCL@tFNAs。该平台利用四面体框架核酸（tetrahedral framework nucleic acids， tFNAs），通过简单的沃森-克里克碱基配对，修饰了一种基于适配体的靶向NCL的蛋白水解靶向嵌合体（proteolysis-targeting chimera， PROTAC）。dNCL@tFNAs表现出显著的稳定性、改善的眼部渗透性和降解效率。机制研究表明，膜相关NCL促进了dNCL@tFNAs被内皮细胞摄取，随后激活胞质中的PROTAC机制，通过泛素-蛋白酶体途径降解细胞内NCL。体内研究证明，dNCL@tFNAs可通过微创的结膜下注射给药，有效抑制脉络膜新生血管，且安全性良好。综上所述，本研究建立了一种可编程的递送与降解模式，用于治疗脉络膜新生血管及其他眼部新生血管疾病。
**研究背景与问题**
年龄相关性黄斑变性（AMD）是60岁以上人群不可逆视力丧失的主要原因，其中新生血管性AMD（nAMD）以脉络膜新生血管（CNV）形成为特征，是导致严重视力丧失的主要亚型。目前，玻璃体内注射抗血管内皮生长因子（VEGF）药物是nAMD的一线治疗方案。然而，该疗法存在显著局限性：需要频繁、重复的玻璃体内注射，给患者带来沉重的心理和经济负担，并降低长期治疗依从性；累积的药物暴露和侵入性操作增加了眼内感染、视网膜结构损伤等不良事件风险；此外，约60%的患者对抗VEGF治疗反应不佳，且部分初始有效者会逐渐产生耐药性。因此，临床迫切需要寻找超越VEGF的新治疗靶点，并开发能够高效递送药物、提高患者顺应性的优化策略。
**研究目标与意义**
本研究旨在探索核仁素（NCL）作为治疗CNV的新靶点，并构建一种基于四面体框架核酸（tFNAs）的纳米递送平台，负载靶向NCL的蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC），以实现对CNV的靶向治疗。该研究发表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》期刊上，其重要意义在于：1）验证了NCL在CNV病变中的表达上调和膜易位，为其作为治疗靶点提供了理论依据；2）成功构建了一种集靶向递送、蛋白降解和跨眼部屏障能力于一体的新型纳米治疗平台（dNCL@tFNAs）；3）证明了通过微创结膜下注射该平台即可有效抑制CNV，为开发侵入性更小、患者顺应性更高的眼部新生血管疾病疗法提供了新思路。
**主要关键技术方法**
研究人员采用了多种关键技术方法：1）**分子构建与表征**：通过点击化学反应合成NCL靶向的PROTAC（dNCL），并利用tFNAs的自组装特性，通过碱基互补配对将dNCL负载到tFNAs上，形成dNCL@tFNAs复合物。利用琼脂糖凝胶电泳、原子力显微镜（AFM）、动态光散射（DLS）和Zeta电位分析对复合物进行表征。2）**细胞与动物模型**：使用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和成人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）进行体外研究。采用激光诱导的C57BL/6小鼠CNV模型进行体内疗效和安全性评估。3）**功能与机制分析**：通过蛋白质印迹（Western blot）、免疫荧光、流式细胞术、划痕愈合实验、管形成实验和EdU细胞增殖实验，评估dNCL@tFNAs的细胞摄取、NCL降解效率以及对内皮细胞迁移、成管和增殖的抑制作用。利用体外ARPE-19单层通透性模型评估其跨血-视网膜屏障能力。4）**体内成像与评估**：采用活体光学成像（IVIS）、光学相干断层扫描（OCT）、眼底荧光血管造影（FFA）和脉络膜辅片等技术，评估dNCL@tFNAs在眼内的分布、靶向性以及对CNV病变厚度、面积、渗漏和体积的治疗效果。通过全面的眼部检查（如角膜荧光素染色、视网膜厚度分析、TUNEL染色、炎症因子检测、视网膜电图）和主要器官组织病理学检查及血清生化指标分析，评估其安全性。
**研究结果**
**1. 表征NCL在CNV病变中的表达及dNCL@tFNAs的构建**
研究人员发现，在激光诱导的CNV小鼠模型中，Cy5标记的NCL特异性适配体AS1411在视网膜新生血管病变区域特异性富集，并与CD31阳性的新生血管共定位。蛋白质印迹分析证实视网膜色素上皮（RPE）-脉络膜组织中NCL表达上调。在VEGF刺激的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中，NCL发生显著的细胞表面易位。基于此，研究人员合成了NCL靶向PROTAC（dNCL），并通过碱基配对将其负载到tFNAs上，成功构建了dNCL@tFNAs复合物。表征显示，复合物成功形成，粒径增加，血清稳定性显著优于单独的tFNAs。
**2. dNCL@tFNAs被内皮细胞高效内化并降解NCL**
流式细胞术显示，与dNCL相比，dNCL@tFNAs被HUVECs摄取的效率显著增强，且摄取快速（1小时即可观察到），并能够从溶酶体中逃逸。dNCL@tFNAs对HUVECs表现出更强的靶向特异性（与ARPE-19细胞相比）。体外RPE通透性模型证明，dNCL@tFNAs跨ARPE-19单层屏障的能力显著优于dNCL。机制上，其内化可能与巨胞饮途径有关。直接向培养基中添加dNCL@tFNAs能以剂量和时间依赖的方式有效诱导NCL降解，并显著缩短细胞内NCL的半衰期。这种降解作用具有特异性，且可被蛋白酶体抑制剂MG132阻断，而不受溶酶体抑制剂氯喹（CQ）影响，表明降解主要通过蛋白酶体途径介导。
**3. dNCL@tFNAs显著抑制体外血管生成**
在VEGF刺激下，dNCL@tFNAs对内皮细胞迁移、成管和增殖的抑制作用比单独的dNCL或tFNAs更显著。即使在无VEGF刺激下，dNCL@tFNAs也表现出明显的抑制活性，但在VEGF存在时抑制效果更强，表明其对VEGF诱导的血管生成具有增强的抑制活性。
**4. 结膜下注射的dNCL@tFNAs可穿透眼部屏障并富集于CNV病变**
比较滴眼和结膜下注射两种非玻璃体内给药途径，发现结膜下注射药物损失更少，且荧光信号可在眼内保留长达48小时。体内动力学显示，结膜下注射dNCL@tFNAs后6小时，视网膜即可检测到Cy5荧光信号，并随时间积累。而在CNV模型小鼠中，dNCL@tFNAs优先在CNV病变区域积累，并与CD31阳性新生血管强烈共定位，在正常小鼠视网膜或CNV模型小鼠的非病变区域则无显著积累，证明了其对病理性新生血管的优异靶向性。
**5. dNCL@tFNAs在体内显示出卓越的抗血管生成活性且无明显毒性**
在激光诱导的CNV小鼠模型中，结膜下注射dNCL@tFNAs或玻璃体内注射阳性对照药康柏西普，均能显著减少CNV病变的厚度和面积、减轻血管渗漏、缩小CNV体积，而单独的dNCL或tFNAs则无此效果。全面的安全性评估表明，结膜下注射dNCL@tFNAs后，未观察到明显的眼部毒性（角膜、视网膜结构、细胞凋亡、炎症因子、视网膜功能）或全身毒性（主要器官病理改变及血清AST、ALT、BUN水平均在正常范围），显示出良好的眼部和全身安全性。
**讨论与结论总结**
讨论部分指出，尽管抗VEGF疗法有效，但其长期应用面临挑战，包括可能破坏视网膜血管稳态、存在全身不良反应风险，且无法满足所有临床需求。因此，开发针对VEGF以外新靶点的疗法以及能够高效递送至眼后段的非侵入性或微创给药策略至关重要。本研究证实，VEGF刺激诱导NCL在血管生成内皮细胞中从细胞核易位至细胞膜，这为靶向NCL递送和降解以抑制CNV提供了理论依据。研究人员开发的dNCL@tFNAs平台成功实现了对CNV病变的特异性积累和NCL的高效降解。机制上，该平台通过巨胞饮途径介导初始内化以清除膜相关NCL，随后逃逸溶酶体捕获，并利用胞质PROTAC机制通过泛素-蛋白酶体途径降解细胞内NCL，展现了其针对致病性膜蛋白和细胞内蛋白的双重降解能力。此外，dNCL@tFNAs具有良好的血清稳定性，且tFNAs作为载体未干扰dNCL的核心功能。尽管在CNV小鼠模型中观察到明确疗效，但单次给药能否产生持续效果以及最佳治疗方案仍需进一步研究。
**结论**：本研究确定了NCL作为CNV治疗的理想递送和治疗靶点，并由此开发了一种基于tFNAs的递送与降解平台，为传统的玻璃体内注射提供了一种可行且侵入性更小的替代方案。dNCL@tFNAs改善了眼部屏障渗透性，提高了治疗效率，并具有良好的安全性，为CNV及其他眼部新生血管疾病的治疗建立了一种新的治疗模式。
