应用转录组断层成像(Transcriptome Tomography, TT)构建亨廷顿舞蹈症(Huntington's disease, HD)小鼠脑基因表达全脑模型揭示共表达网络的选择性破坏

《Scientific Reports》：Topological modeling of gene expression in the brain with Huntington’s disease reveals selective disruption of co-expression network

　　

摘要：研究人员应用转录组断层成像(transcriptome tomography, TT)构建了早期亨廷顿舞蹈症(Huntington's disease, HD) R6/2小鼠（泛表达含约150个CAG重复截短人突变HTT蛋白）的全脑模型。中型多棘神经元(medium spiny neuron, MSN)相关基因在HD脑中表现出与野生型Htt的表达相似性异常。Bdnf(Brain-derived neurotrophic factor, 脑源性神经营养因子)是这些基因最可能的上游调节因子。Bdnf调节因子Smarca4(SWI/SNF-related matrix-associated actin-dependent regulator of chromatin subfamily A member 4, 也称Brg1)在对照脑中与野生型Htt相似表达，但在HD中未观察到该现象，提示Smarca4可能参与HD中的谷氨酸兴奋毒性。Lhx6(LIM homeobox protein 6, MSN相关通路发育的主基因，出生后及成年期通常保守)在HD共表达网络中丢失。网络枢纽节点Fcho1(FCH domain only protein 1)丢失了涉及Lhx6与线粒体基因簇的连接。Smarca4、Lhx6及Fcho1在共表达中的丢失可能促成HD中时空特异性的神经元丢失。

论文解读：亨廷顿舞蹈症脑基因表达拓扑建模揭示共表达网络选择性破坏

该研究由Okamura-Oho等学者开展，发表于《Scientific Reports》。亨廷顿舞蹈症(Huntington's disease, HD)由HTT基因外显子1区CAG三核苷酸重复异常扩展引起，特征为纹状体中型多棘神经元(medium spiny neuron, MSN)选择性丢失，随后沿皮质-纹状体通路逆行累及皮质神经元。尽管广泛表达的突变Htt导致多种细胞功能障碍，但其如何引发特定脑区、特定神经元亚型及时相性的选择性丢失机制尚不清楚。为探究此分子基础，研究人员对早期HD模型小鼠(R6/2, 5周龄，表现细微运动异常)进行全脑系统性基因表达分析，采用转录组断层成像(transcriptome tomography, TT)整合三维(anatomical)表达图谱与转录本共表达网络的拓扑视图，识别与野生型Htt表达模式相似(similarly expressed transcripts to Htt, Htt-SETs)的基因及其在HD中的共表达改变，并分析关键调控基因与网络枢纽节点。

主要关键技术方法：

取5周龄雄性R6/2 HD模型小鼠(CAG重复150–162)及同窝野生型对照(wild-type littermate, Cont)各5只，经心灌注RNAlater后取全脑。采用转录组断层成像(TT)将全脑连续切片分馏为42(HD)和43(Cont)个组分，使用Agilent SurePrint G3 Mouse GE 8×60K微阵列检测>40,000个转录本表达密度；将表达数据与切片块面图像映射到小鼠脑磁共振(Magnetic Resonance, MR)图像坐标空间重建三维基因表达图谱。计算转录本间Pearson相关系数(r＞0.85)构建无标度共表达网络，筛选Htt-SETs(r_Htt-SET＞0.85)，利用Markov聚类算法(MCL)划分网络簇，Cytoscape进行网络传播(network propagation)与介数中心性(betweenness centrality)分析鉴定枢纽节点，结合Ingenuity Pathway Analysis(IPA)进行功能注释与上游调节因子预测。正常小鼠出生后3天、7天、3周数据集用于定义保守共表达边。

研究结果

Integrated analysis of anatomical expression maps and topological co-expression network graphs of transcripts with expression patterns similar to Htt (Htt-SETs)

通过三维表达图谱发现野生型Htt在全脑广泛表达，HD脑中表达更广泛。谷氨酸受体亚基Grin1(NMDA receptor subunit 1, NMDA1)在对照脑与Htt表达相似，HD中纹状体高表达、苍白球低表达致相似性丧失；突触黏附分子Nrxn1(Neurexin 1)对照脑腹侧前脑低表达，HD脑广泛表达致与Htt相似性增加。构建Htt-SET共表达网络(210个节点，r＞0.85)，其中56节点HD/Cont不变，71节点(含Grin1)在HD中丢失与Htt共表达，83节点(含Nrxn1)在HD中获得与Htt共表达。生物信息学分析显示Htt-SETs富集NMDA1受体阳性及GABA能神经元相关基因，BDNF为Cluster #2最可能的上游调节因子(p＜1.66×10^?5)，其下游13个基因(如Grin1、Mapt、Napb等)在HD中出现共表达丢失或获得。Smarca4(Brg1/BAF复合体亚基，Bdnf转录活性依赖的染色质重塑因子)及Mef2d(myocyte enhancer factor 2D)为Bdnf表达上游调节因子，Smarca4在对照脑与Htt及Grin1共表达，HD中该共表达丢失。

Alterations in the Htt-linked co-expression network in HD

选取正常小鼠出生后3天、7天、3周保守高相似转录本对(pair)，构建含4617节点、148161边的Htt关联网络(Htt-linked network)。其中3789节点(82%)、110953边(75%)在HD/Cont均存在(不变)；508节点(11%)、26705边(18%)仅在Cont存在(在HD丢失)；320节点(7%)、10503边(7%)仅在HD存在(保留/获得)。丢失节点富集编码基因(22%编码基因改变 vs 非编码基因较低)，保留部分富含lncRNA。表明突变Htt引起广泛但非均匀的网络重构，整体网络具一定稳健性。

Clustering analysis of the Htt-linked network

MCL算法将Htt-linked network划分为25个簇。Cluster #1(最大簇，1524节点)富集线粒体氧化代谢、核糖体、泛素化等管家基因，93%节点不变，少量丢失边连接Sub-cluster #1(线粒体功能相关)与Cluster #3。Cluster #2含210个Htt-SETs及24邻近节点，富集NMDA受体阳性及GABA能神经元基因，BDNF为最可能上游调节因子；邻近含Ntrk2(BDNF receptor TrkB)、Lmtk3、Tmeff1。Smarca4在该簇与Htt共表达且在HD中丢失。Cluster #15(26节点，含GABA_A受体亚基Gabrb2)与Cluster #19(21节点，含烟碱型胆碱能受体Chrna4)连接Cluster #2，部分腺苷酸环化酶(Adcy9/Adcy7)分别位于Cluster #2/#19。Cluster #3(89节点，孤立)含脑图式形成转录因子Lhx2、Lhx6、Emx1/2、Tbr1及AMPA受体Cnih2/3、毒蕈碱受体Chrm1；除Lhx6、Ccdc106、Smpd3丢失及Klf16、Msantd1保留外基本不变。Lhx6二度共表达网络在对照脑保守含Foxo6、Tbr1、Foxg1、Nr2e1、Emx2等，HD中Lhx6节点退出该网络；三维表达图谱示Lhx6在HD脑弥散表达，失去腹侧前脑特异性。

Analysis of network hub genes

介数中心性＞0.015的枢纽节点中，Fcho1(网格蛋白介导内吞适配蛋白，微调突触囊泡内吞)与Fbxw5连接Sub-cluster #1(线粒体功能)、Sub-cluster #3(Lhx6所在，脑发育/图式形成基因)及Cluster #9(RNA质量控制/细胞命运决定)。Fcho1传播网络富集HD病理相关基因(44个, p＜1.2×10^?6，含Lhx6)、突触发生基因(18个)及线粒体功能障碍基因(14个)。HD中Fcho1、Fbxw5及34%传播网络边丢失(约为全网络平均丢失率2倍)，Sub-cluster #1至Sub-cluster #3经由Fcho1的最短路径消失。另一枢纽Smarca4连接Cluster #2(Htt-SETs)与Cluster #9，HD中Smarca4及62条边丢失，Cluster #9内Smg9、Elac2、Scyl1丢失，Cabin1保留。两传播子网仅共享3%节点且互不交叠，提示突变Htt引起相对独立的拓扑与分子特征改变。

讨论与结论

研究人员总结：HD中产后保守的共表达网络发生选择性改变，集中于BDNF相关通路(Cluster #2/Htt-SETs)、脑图式形成基因网络(Cluster #3中Lhx6丢失共表达)、线粒体功能相关亚簇(Sub-cluster #1)及细胞命运决定基因簇(Cluster #9)。Smarca4作为野生型Htt与活动依赖性Bdnf表达间的潜在共表达联系节点，在HD中丧失与Htt共表达，提示BAF复合物介导的染色质重塑及Bdnf调控网络可能受损。Lhx6——胚胎期指定MGE来源GABA能MSN及皮质-纹状体通路的关键LIM同源框基因，成年脑中保守的Lhx6-Foxo6-Tbr1共表达网络在HD早期(5周)解体，Lhx6空间表达弥散化。Fcho1作为连接线粒体功能相关基因簇与Lhx6所在发育基因簇的枢纽，其在HD中连接丢失可能关联线粒体功能障碍与选择性神经元易损性。Smarca4、Lhx6及Fcho1共表达丢失可能促成HD中纹状体MSN的时空特异性丢失。研究局限含三维图谱解剖分辨率有限、未做单细胞分辨及功能验证实验、单时间点(5周)分析；数据为假设生成性质，需后续细胞类型分辨转录组与功能实验验证。该拓扑建模方法提供全脑无偏倚共表达概览，所建数据集存于ViBrism DB供进一步研究。