高粱多酚在阿尔茨海默病中的神经保护作用：体外和计算机辅助分析

《Nutrients》：Neuroprotective Effects of Sorghum Polyphenol in Alzheimer’s Disease: In Vitro and In Silico Analyses

　　

背景/目的：人脑中淀粉样蛋白-β（Aβ）老年斑的积累是阿尔茨海默病（AD）的主要标志，表现为记忆和认知功能的进行性衰退，目前缺乏有效的疾病修饰疗法。新出现的证据表明，富含多酚的植物食品是AD的潜在补充疗法。方法：在本研究中，研究人员调查了来自三种高粱基因型的粗多酚提取物（CPEs）和纯化多酚提取物（PPEs）抑制Aβ₄₂诱导的MC-65细胞毒性的能力。使用硫黄素T（ThT）荧光、细胞活力、线粒体功能、氧化应激测定和Western blotting，以及RNA测序和计算分析，来表征细胞对多酚处理的功能和转录组反应。结果：CPEs和PPEs将Aβ₄₂聚集抑制了67–76%，并显著减少了Aβ寡聚体种类。这些提取物使细胞活力对抗Aβ诱导的毒性提高了70%以上，降低了细胞内氧化应激，并将线粒体活性增强了80%以上。转录组分析揭示了与铁死亡（ferroptosis）和MAPK/NF-κB信号通路相关的基因的差异调节，表明炎症和氧化应激反应的调节是观察到的神经保护作用的机制。结论：本研究表明，来自黑色和红色高粱基因型的多酚提取物在MC-65细胞中针对Aβ₄₂毒性发挥强大的多靶点神经保护作用。这些发现支持进一步评估高粱衍生的多酚作为AD的补充治疗候选物，需要体内研究来确定其疗效和转化潜力。

**论文解读：高粱多酚对阿尔茨海默病的神经保护作用——基于体外与计算机辅助分析的机制研究**

**研究背景与问题**

阿尔茨海默病（AD）是一种进行性神经退行性疾病，是世界范围内痴呆症的主要病因，目前尚无有效的疾病修饰疗法。AD的核心病理特征包括淀粉样蛋白β₄₂（Aβ₄₂）老年斑的积累、tau蛋白过度磷酸化、氧化应激、线粒体功能障碍和神经炎症。由于AD的多因素性质，多靶点治疗策略（尤其是来源于天然产物的策略）引起了越来越多的关注。富含多酚的植物食品含有具有类药物特性的生物活性化合物，可调节Aβ聚集、氧化损伤和神经炎症等AD相关病理过程。橄榄叶、肉桂、香茶菜、葱属植物玫瑰以及多种浆果的提取物已在体外显示出对Aβ₄₂聚集的强效抑制作用。然而，高粱（*Sorghum bicolor*）作为一种在亚洲和非洲广泛食用的富含营养和多酚的谷物，其治疗潜力尚未得到充分探索。研究人员的先前工作首次全面调查了高粱多酚提取物的神经保护特性，证明来自六种基因型的提取物可抑制BE-M17神经母细胞瘤细胞中的Aβ₄₂聚集、tau磷酸化和Aβ诱导的毒性，但潜在的分子机制尚未完全阐明。因此，本研究旨在通过整合生化测定、转录组分析和计算生物学方法，深入探究高粱多酚提取物在AD相关病理过程中的作用机制。

**研究方法概述**

本研究选取了先前工作中显示最强神经保护作用的三种高粱基因型（黑色、红棕色和红色），分别制备了粗多酚提取物（CPEs）和纯化多酚提取物（PPEs）。主要关键技术方法包括：硫黄素T（ThT）荧光测定法用于评估Aβ₄₂聚集动力学；MTS细胞活力测定法检测Aβ诱导的毒性；Mitochondrial ToxGlo?试剂盒测量细胞内三磷酸腺苷（ATP）水平；MitoTracker? Deep Red活细胞成像评估线粒体形态和活性；CellROX? Orange试剂检测细胞内活性氧（ROS）；Amplex? Red试剂盒测定过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（PER）活性；Western blotting分析Aβ寡聚体清除；RNA测序（RNA-seq）用于转录组分析，并结合来自基因表达综合数据库（GEO）的AD数据集（GSE5281）进行生物信息学挖掘，以及通过分子对接评估槲皮素（quercetin）与靶蛋白的结合。细胞模型使用MC-65细胞（一种条件性表达淀粉样前体蛋白C-99片段的人中枢神经系统细胞系），该细胞系由美国华盛顿大学的Bryce Sopher惠赠。高粱样本来源：黑色基因型（Shawaya Short Black 1）由澳大利亚昆士兰州农业与渔业部捐赠；红棕色基因型购自西澳大利亚州弗兰克兰的一个农场；红色基因型粉末购自西澳大利亚州珀斯的当地市场。

**研究结果**

**3.1. ThT荧光测定**：通过ThT荧光测定评估高粱CPEs和PPEs对Aβ₄₂聚集动力学的影响。Aβ₄₂单独孵育产生典型的S形聚集曲线，而所有多酚提取物均显著延迟并减少了纤维形成，将聚集峰移至13–23小时，并将最终荧光降至213.6–964 AU。在50 μg/mL浓度下，除PRS（纯化红高粱）外，所有提取物将荧光降低了67.15–76.18%（p < 0.0001），PRS仅降低8.4%。总体抑制排名为CPEs < PPEs < 槲皮素，黑色高粱提取物显示出最强的抗淀粉样蛋白活性。结论：高粱多酚提取物（尤其是黑色基因型）在体外对Aβ₄₂纤维形成具有强效抑制作用。

**3.2. CPEs和PPEs抑制MC-65细胞中Aβ诱导的毒性**：MTS测定显示，所有PPEs在250–500 μg/mL浓度下均强效抑制Aβ诱导的毒性，细胞存活率范围为64–100%（CPEs为42–77%）。CBS（粗黑高粱）在两种浓度下均产生最强的神经保护（59–72%存活率），PBS（纯化黑高粱）、PRB（纯化红棕高粱）和PRS处理分别导致56–92%、75–94%和79–95%的细胞活力。结论：多酚提取物以浓度和基因型依赖性方式抑制Aβ诱导的神经毒性。

**3.3. CPEs和PPEs恢复MC-65细胞中的ATP水平**：ATP测定显示，No Tet.（无四环素）对照细胞的ATP在72小时后显著下降，而250–500 μg/mL的多酚提取物以剂量和基因型依赖性方式抑制ATP下降。在72小时，PBS（250 μg/mL）和槲皮素（125 μg/mL）最有效，分别使ATP恢复61.09%和59.27%，其次是CBS（49.54%）和PRS（14.29%）。结论：高粱多酚提取物对Aβ诱导的线粒体功能障碍具有神经保护作用。

**3.4. CPEs和PPEs通过共定位增加MC-65细胞中的线粒体活性**：MitoTracker活细胞成像显示，No Tet.细胞的线粒体网络呈碎片化，而CBS、PBS、PRS或槲皮素处理保留了细胞体中的网状线粒体网络。定量分析显示，所有处理组的MitoTracker荧光强度显著高于No Tet.细胞（98.54–108.69% of Tet.；p < 0.0001），其中PBS产生的线粒体活性最强。结论：多酚提取物保护线粒体结构完整性并恢复活性。

**3.5. CPEs和PPEs对细胞内ROS产生的影响**：CellROX? Orange染色显示，No Tet.细胞核区域产生强烈荧光信号，表明ROS积累升高；而所有处理细胞均呈现低荧光强度，表明细胞内ROS水平降低。结论：多酚提取物有效降低Aβ诱导的氧化应激。

**3.6. CPEs和PPEs增强过氧化氢酶和过氧化物酶活性**：与Tet.对照相比，Aβ产生的No Tet.细胞中CAT和PER活性显著耗竭。处理72小时后，CBS使CAT活性增强60.5%，PBS增强26.3%，槲皮素增强24.5%，PRS增强13.9%；除PRS外，所有处理使PER活性增加约两倍。结论：高粱多酚提取物以基因型依赖性方式增强内源性抗氧化防御。

**3.7. CPEs和PPEs促进细胞内Aβ的清除**：Western blot分析显示，No Tet.细胞中高分子量小寡聚体（二聚体、三聚体和四聚体）显著增加。CBS、PBS、PRS或槲皮素处理分别将这些寡聚体的丰度降低了75%、77%、89%和83%（p < 0.0001），而单体水平基本不变。PRS显示出最强的寡聚体清除效果。结论：多酚提取物通过抑制毒性Aβ₄₂寡聚体形成介导神经保护。

**3.8. 高粱多酚提取物调节MAPK/NF-κB和铁死亡通路**：RNA测序显示，在No Tet.细胞中，MAPK/NF-κB依赖性基因（JUN、ROR2、C5AR1、COX-2、PPP1R15A和NF-κB）显著上调，而铁死亡抑制蛋白1（FSP1）显著下调。CBS、PBS、PRS或槲皮素处理显著下调了所有MAPK/NF-κB相关基因，同时显著上调了FSP1。CBS和PBS对促炎基因的抑制最显著，槲皮素对FSP1的上调最高。结论：高粱多酚提取物通过抑制炎症和氧化应激信号并增强铁死亡抑制来发挥神经保护作用。

**3.9. 槲皮素与MAPK/NF-κB/铁死亡相关基因的相互作用**：生物信息学分析（GSE5281数据集）鉴定出166个与AD相关的潜在靶点，这些靶点预测与槲皮素相互作用。通路富集分析揭示了MAPK/NF-κB信号、氧化应激调节、凋亡、铁死亡和炎症反应等14条显著AD相关通路。枢纽基因分析确定了15个高节点强度的靶点，包括JUN、ROR2、COX-2、NF-κB和FSP1。分子对接显示槲皮素与这些靶蛋白（包括ROR2、C5AR1、COX-2、NF-κB、FSP1和PPP1R15A）具有强结合亲和力（结合能?5.0至?9.7 kcal mol^?1）。结论：槲皮素（高粱中主要多酚）通过同时调节炎症、氧化应激、线粒体完整性和Aβ₄₂聚集抑制来发挥多靶点神经保护。

**讨论与结论**

讨论部分指出，高粱多酚提取物（尤其是CBS和PBS）有效抑制Aβ₄₂纤维形成、减轻线粒体功能障碍、恢复抗氧化酶活性并调节AD相关基因和通路。纯化提取物（PPEs）活性强于粗提物（CPEs），但粗提物仍保留显著生物活性。RNA测序揭示的MAPK/NF-κB和铁死亡通路调节是神经保护的重要机制。公共数据集分析证实了这些靶点在人类AD脑组织中的失调。分子对接支持槲皮素与多个靶点的强相互作用。研究结论（翻译）：将对接结果与RNA测序结果整合，加强了富含槲皮素的高粱多酚提取物通过多靶点调节（同时影响炎症、氧化应激、线粒体完整性和蛋白质聚集）发挥神经保护作用的结论。总体而言，这些发现表明CBS、PBS和PRS可能通过抑制MAPK/NF-κB激活和铁死亡，同时增强神经元对Aβ诱导毒性的抵抗力来抑制AD进展。该论文发表在《Nutrients》。