通过无金属方法合成并评估基于苯并恶嗪酮骨架的吡啶基吡唑衍生物的杀菌活性

《International Journal of Molecular Sciences》：Synthesis and Fungicidal Evaluation of Pyridylpyrazole Derivatives Bearing a Benzoxazinone Scaffold via a Metal-Free Approach

　　

摘要：为开发新型、绿色、高效的杀菌剂，研究人员通过无金属催化路线，利用吡唑氟菌胺（pyraziflumid）中间体，设计并合成了一系列苯并恶嗪酮功能化的吡啶基吡唑衍生物（8a–8z）。合成过程包括重氮化、环化、水解以及甲磺酰氯介导的脱水环化。优化条件（水中3.0当量吡啶，BF₄^?作为抗衡离子，25 °C，3小时）下最高产率达63.7%。生物测定显示，在50 mg/L浓度下，化合物8p对玉米锈病（Puccinia polysora）的抑制率为92.0%，化合物8q对黄瓜炭疽病（Colletotrichum orbiculare）的抑制率为90.5%。芳香环和吡啶环上的取代基共同调节杀菌活性，并表现出明显的病原体依赖性选择性。分子对接结果表明，化合物8j与琥珀酸脱氢酶（SDH）的结合能为-11.8 kcal/mol，其羰基与Lys163之间的极性相互作用是增强结合亲和力的关键。本研究为吡啶基吡唑类杀菌剂的绿色合成与合理设计提供了科学依据。

本研究旨在开发新型、绿色且高效的杀菌剂，以应对玉米锈病和黄瓜炭疽病等重大植物病害对全球作物生产的持续威胁。含氮杂环，特别是吡啶和吡唑环，因其优异的生物活性而成为现代农用化学品发现中的优势骨架。然而，传统构建吡啶-吡唑C-C键的方法主要依赖于过渡金属催化的交叉偶联反应（如Suzuki–Miyaura偶联），这些方法存在催化剂成本高、反应温度高以及最终产品中重金属残留风险等问题，限制了其在绿色可持续农药开发中的应用。因此，开发无金属替代合成策略具有重要现实意义。

研究人员报道了一种高效的无金属策略来构建吡啶基吡唑衍生物。该策略的关键步骤是在温和条件下，通过取代苯胺重氮化后与取代吡啶直接环化形成C-C键，无需任何金属催化剂，且仅以氮气为副产物，过程更为清洁。随后，通过水解以及甲磺酰氯存在下与各种取代邻氨基苯甲酸进行脱水环化，系统性地合成了一个含有苯并恶嗪酮（benzoxazinone）骨架的吡啶基吡唑衍生物库（8a–8z）。

为开展研究，研究人员主要采用了以下关键技术方法：1）**无金属合成化学**：以吡唑氟菌胺中间体和吡啶为模型底物，通过重氮化/环化反应构建吡啶基吡唑核心结构，系统优化了溶剂、抗衡离子、吡啶用量、反应时间和温度等条件。2）**结构衍生与修饰**：以上述合成的吡啶基吡唑化合物为起始原料，经碱性水解和酸化得到羧酸中间体，再与不同取代的邻氨基苯甲酸在甲磺酰氯存在下反应，引入具有不同电子效应和空间位阻的取代基，最终得到目标化合物。3）**生物活性测定**：对玉米锈病进行了体内（in vivo）生物测定，对黄瓜炭疽病进行了体外（in vitro）菌丝生长抑制测定，评估了目标化合物的杀菌活性。4）**分子模拟与对接分析**：使用AutoDock 4.2和Vina软件，以琥珀酸脱氢酶（SDH）为靶蛋白（PDB ID: 9QDL），对合成化合物进行了分子对接和虚拟筛选，分析了其与靶点的结合模式。

**研究结果**如下：
**2.1. 新型吡啶基吡唑衍生物的合成优化**：研究人员开发了不同于传统Suzuki偶联的无金属策略。以水为溶剂、BF₄^?为抗衡离子时获得最佳产率（56.4%）。通过正交实验确定最优条件为：3.0当量吡啶、25 °C反应3小时。该策略具有广泛的底物适用性，成功合成了一系列吡啶基吡唑衍生物（5a–5s）。研究发现，吡啶取代基的空间位阻是控制区域选择性的主导因素，而电子效应主要影响底物反应活性。
**2.2. 目标抗真菌化合物的合成**：以苯并恶嗪酮骨架为核心，通过引入不同取代基，合成了目标衍生物8a–8z。
**2.3. 体外和体内杀菌活性测定**：生物测定结果表明，大多数化合物对两种植物病害具有良好的抑制效果。针对玉米锈病，邻氨基苯甲酸衍生的苯环上的取代基显著影响活性，R1位甲基和R2位甲基或氯取代的化合物综合活性最佳。例如，化合物8j（苯环双甲基取代）在200 mg/L下抑制率为100%；化合物8p（R1 = CH₃, R2 = Cl）在200 mg/L和50 mg/L下的抑制率分别为97.0%和92.0%。针对黄瓜炭疽病，则观察到不同的构效关系趋势：苯环上庞大的二甲基取代导致活性较差，而中性氢原子和卤素原子（氟、氯、溴）则有利于活性。化合物8q（R2 = Br）在50 mg/L下抑制率最高（90.5%）。对位氯代吡啶侧链被确定为提高抗黄瓜炭疽病活性的关键优势片段。目标化合物对玉米锈病的EC₅₀值在16.83至23.49 mg/L之间，虽高于阳性对照嘧菌酯（azoxystrobin, EC₅₀ = 1.411 mg/L），但仍显示出潜在活性。
**2.4. 对接分析**：分子对接虚拟筛选显示，所有目标化合物（8a–8z）都能自发结合SDH蛋白，其结合能力与杀菌活性呈显著正相关。其中，化合物8j结合能最优（-11.8 kcal/mol），显著优于对照杀菌剂氟唑菌酰胺（fluxapyroxad, -8.9 kcal/mol）。8j通过其羰基与Lys163形成稳定的极性相互作用，以及末端氯原子提供的有利亲脂性，增强了结合亲和力。而氟唑菌酰胺虽能插入结合腔更深并与Leu195和Met87形成额外的疏水相互作用，但未能与Lys163建立稳定的极性作用，导致结合稳定性较低。构效关系分析表明，苯并恶嗪酮骨架为靶蛋白结合提供了稳定基础，侧链取代基的电子和空间效应能显著改变分子结合模式。

**讨论与结论**：本研究成功通过无金属策略高效合成了一系列吡啶基吡唑-苯并恶嗪酮衍生物（8a–8z）。优化反应条件为：3.0当量吡啶、水为溶剂、BF₄^?为抗衡离子、25 °C反应3小时。大多数目标化合物对玉米锈病和黄瓜炭疽病表现出良好的杀菌活性。其中，化合物8p对玉米锈病、化合物8q对黄瓜炭疽病表现出优异的抑制活性。杀菌活性受苯并恶嗪酮骨架上取代基的电子效应、空间位阻以及吡啶侧链杂环结构的共同调控，且两种病原体表现出明显的结构偏好性，这归因于其靶点结合口袋的结构差异。分子对接结果明确了与Lys163的极性相互作用是提高该系列化合物结合亲和力的关键因素。本研究验证了无金属合成策略的可行性，并为开发可持续、低风险、广谱的农用杀菌剂提供了重要的结构基础。研究人员在结论中指出，尽管本研究聚焦于杀菌活性，未来工作将对先导化合物进行初步毒性评估（如细胞毒性或生态毒性），以进一步评估其作为农用化学品候选物的潜力。