综述：利用融合蛋白技术增强L-天冬酰胺酶药理特性的研究

《Biomolecules》：Fusion Protein Technology to Enhance Pharmacological Properties of L-Asparaginases

　　

L-天冬酰胺酶（L-asparaginase, L-ASNase）是治疗急性淋巴细胞白血病及其他血液系统恶性肿瘤的关键治疗酶，但其临床应用受限于较短的血浆半衰期、显著毒性及免疫原性。为解决这些局限，目前已开发多种策略，包括将酶与聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）偶联，以及使用来自低免疫原性替代来源的酶。然而，肿瘤细胞的靶向递送——尤其是针对实体瘤——仍是主要挑战。蛋白融合技术通过将稳定性增强、循环时间延长、靶向递送实现及多功能结构域整合于单一构建体中，可同时解决多项局限，已成为改善L-天冬酰胺酶药理特性的有前景方法。本综述分析了基于L-天冬酰胺酶的融合蛋白设计现有策略，包括用于改善药代动力学的蛋白结构域融合，以及用于增强局部细胞毒性的靶向肽或蛋白融合。对比分析表明，弹性蛋白样肽（elastin-like peptide, ELP）类构建体主要延长L-天冬酰胺酶半衰期，而白蛋白结合域（albumin-binding domain, ABD）与肝素结合域（heparin-binding domain, HBD）类融合可在半衰期延长与体内疗效两方面均带来更显著的改善。但现有策略仍需进一步验证以确保选择性提升。总体而言，融合蛋白技术代表了下一代L-天冬酰胺酶治疗药物开发的极具潜力的途径。

1. 1.
   引言
   生物制药技术的快速发展推动了针对L-天冬酰胺酶在内的新型改良疗法的研究。L-天冬酰胺酶是一种化疗酶，被列入世界卫生组织基本药物清单，主要用于治疗急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia, ALL）——这是最常见的儿童恶性肿瘤，也是儿童和青少年癌症相关发病率与死亡率的主要原因之一。其通过降解细胞外L-天冬酰胺发挥作用：与正常细胞不同，ALL细胞及其他部分肿瘤细胞因天冬酰胺合成酶表达较低而无法足量合成L-天冬酰胺，因此该氨基酸缺乏会导致细胞死亡。
   目前已获批临床使用的L-天冬酰胺酶包括大肠杆菌来源（Escherichia coli, EcA II；商品名Spectrila^?、Onconase^?）和菊欧文氏菌来源（Erwinia chrysanthemi, ErA II；商品名Erwinaze^?、Rylaze^?），以及相应的聚乙二醇（PEG）偶联形式（EcA II对应Asparlas^?、Oncospar^?、Pegaspargase^?；ErA II对应Crisantaspase^?）。尽管L-天冬酰胺酶在治疗ALL中有效，但其在血液中的短半衰期及相关不良反应——包括血栓形成、动脉粥样硬化、胰腺炎、急性高血糖、出血、超敏反应及抗酶抗体形成——限制了临床应用。针对这些缺陷，目前已开发多种蛋白修饰策略，其中最常见的是将L-天冬酰胺酶固定于各类载体上，尤其是聚乙二醇。PEG化是最广泛应用的策略，可显著延长L-天冬酰胺酶半衰期，但也存在缺乏肿瘤选择性、耐药性产生、免疫原性及PEG无代谢降解途径等缺点。其他提升疗效的策略还包括联合信号通路抑制剂（如MEK抑制剂或GCN2抑制剂），但目前相关数据仅局限于细胞系及少量体内研究。
   融合蛋白技术是改善L-天冬酰胺酶特性的最具前景的策略之一，可将功能结构域组合以增强稳定性、靶向性或催化活性。相较于其他获得新功能蛋白的方法，该技术具备多项独特优势：可实现靶向递送，包括克服血脑屏障等生物屏障；简化目标蛋白分离；促进多酶复合体组装；减少蛋白生产与纯化步骤；提高重组蛋白产量与溶解度；可在单一构建体中整合多个功能结构域；并可提升催化效率。目前已有多种融合蛋白获批用于治疗免疫、肿瘤、眼科疾病，以及糖尿病与凝血障碍，代表性药物包括依那西普（Enbrel^?）、地尼白介素（Ontak^?）及阿法西普（Amevive^?）等。基于L-天冬酰胺酶的融合蛋白开发始于20世纪90年代初，目前已获得若干具有潜力的构建体，这也是本综述的核心关注对象。
2. 2.
   融合蛋白设计
   2.1 融合蛋白制备通用策略
   融合蛋白通常由效应结构域与功能性载体蛋白组成，效应结构域可增强结合选择性与细胞毒性。在融合蛋白中，一个结构域负责分子识别，另一个则用于改善稳定性、半衰期及其他药理特性（如细胞毒性作用），或实现新型递送途径与功能。设计融合基因时，编码功能结构域的DNA序列可位于载体蛋白编码序列之前或之后，前提是两者之间无终止密码子中断。多肽链内蛋白的顺序会显著影响功能。
   现有融合蛋白制备策略主要包括串联融合、结构域插入及翻译后偶联三类。串联融合依赖直接连接，当蛋白结构域间有足够空间允许正确折叠时可适用；若该方式无效（如游离N端或C端对功能至关重要，或缺乏足够灵活性与长度以避免错误折叠与聚集），可通过在蛋白结构域间引入肽连接子解决。串联排列常见于双特异性抗体融合，例如用于治疗ALL的博纳吐单抗（Blincyto^?），即通过柔性连接子将抗CD19单链可变片段（scFv）与抗CD3 scFv连接。麦芽糖结合蛋白（MBP）与norrin的融合是串联融合的典型实例，MBP作为融合伴侣提升了norrin的溶解度并促进了结构解析。
   结构域插入可分为单次插入与多次插入：单次插入将一个结构域插入另一结构域内部，插入位点通常选择蛋白内固有无序或部分柔性的区域。该策略常用于酶工程（如Cas9）、离子通道及配体或代谢物传感器的改造，已应用LOV2、FKBP12、钙调蛋白等多种插入结构域调控蛋白别构活性。其主要局限在于难以确定合适的插入位点，因为结构域融合可能破坏蛋白结构与功能，且许多蛋白的结构与功能数据有限，最适插入位点通常为蛋白表面的特异性柔性环。
   翻译后偶联方法用于制备无法通过前两类策略获得的融合蛋白，尤其适用于表达过程中对宿主有毒性的蛋白。该方法基于蛋白内经典或非经典氨基酸的修饰，常用策略包括：利用同双功能试剂（如邻苯二甲酰亚胺二马来酰亚胺、双马来酰亚胺或2,3-二溴马来酰亚胺）或点击化学还原二硫键；利用异双功能试剂（如乙烯基膦酸盐或钯-蛋白氧化加成复合物）；此外还包括赖氨酸靶向试剂（如N-羟基琥珀酰亚胺酯）、金属介导偶联策略及靶向替代氨基酸残基或引入非天然氨基酸的试剂。另一种翻译后偶联途径是酶促偶联，利用分选酶、酪氨酸酶、SUMO共轭酶、硫辛酸蛋白连接酶等，在氨基酸侧链功能基团上进行修饰，包括向这些基团添加有机分子、分子内转化（如二硫键形成与蛋白水解）及在蛋白分子间形成共价键。翻译后偶联的主要优势是可实现N端与C端、N端与N端、C端与C端的定向排列，且可在生产后期进行偶联；但缺点包括修饰靶序列的选择性常不足、连接子潜在免疫原性、产物产率评估复杂及可利用半胱氨酸残基有限。
   近年来，生物信息学工具已被用于融合蛋白设计与性质预测，AlphaFold、RoseTTAFold、trRosetta及D-I-TASSER用于结构预测，GROMACS、AMBER、NAMD及CHARMM等软件包用于分子动力学模拟，已在多种抗肿瘤融合蛋白设计中得到成功应用。

2.2 融合蛋白连接子

翻译后蛋白序列会独立折叠为独特的三维结构，蛋白融合常可在减少蛋白酶可及性与限制分子运动的同时保留蛋白结构，但也会因空间位阻导致灵活性下降，从而降低生物活性，因此设计融合蛋白时常需在蛋白间引入连接子肽序列。连接子是天然或合成的短肽序列，天然连接子包括纤维素酶与木聚糖酶中的O-糖基化连接子，富含脯氨酸与羟脯氨酸，可提供抗蛋白酶水解保护。连接子可分为刚性或柔性、可裂解或不可裂解类型。

连接子的灵活性受其组成影响：柔性连接子通常含多个甘氨酸残基，可形成无序环，也可包含丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸与谷氨酸以提升溶解度；丙氨酸与赖氨酸的引入可提高抗蛋白酶水解能力并改善融合蛋白内的结构域分离，(Gly)n与(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n是最常见的柔性连接子序列，可有效分隔融合伴侣并辅助折叠与溶解度维持。刚性连接子（如螺旋结构(EAAAK)n或富含脯氨酸的(XP)n序列，X为任意氨基酸）更适合需要优异结构域分离的场景，已在CAR-T细胞研究中证实可显著提升体内抗肿瘤活性。但刚性连接子也可能在功能结构域间产生空间位阻，降低活性，因此可在结构域间引入可裂解连接子以实现体内功能结构域释放并保留活性，这类连接子可被还原剂或蛋白酶（如肠激酶、凝血酶与半胱氨酸蛋白酶）切割，包括含分子内二硫键的连接子与含凝血酶敏感序列的连接子两类。连接子长度是另一重要参数，影响融合蛋白亚基分离与表达水平，通常更长连接子的蛋白活性更高。目前已开发LinkerDB等多个生物信息学工具与数据库用于连接子选择与设计，设计时需综合考虑长度、组成、结构、蛋白酶切割敏感性及与融合蛋白结构域的相互作用等参数。

1. 3.
   融合蛋白类型
   融合蛋白可大致分为四类功能类别：半衰期延长型融合蛋白、细胞毒性融合蛋白、靶向融合蛋白，以及整合上述多种特性的多功能构建体。
   半衰期延长型融合蛋白通常将分子量小于约70 kDa的治疗性蛋白与抗体衍生物、白蛋白或转铁蛋白融合，以延长血浆半衰期并保留活性，常用融合伴侣包括免疫球蛋白可结晶片段（Fc）、白蛋白、多肽链（如PASylation、XTEN、HAP）及弹性蛋白样肽（ELP）与C端肽（CTP）。目前已获批的Fc融合药物包括依那西普、阿巴西普、阿柏西普等；白蛋白融合药物目前仅有阿必鲁肽（Tanzeum^?）获批，另有白蛋白-干扰素α2b融合蛋白已完成乙型肝炎患者I/II期临床试验；ELP是目前临床试验中最常用的多肽类融合伴侣，已有多个针对糖尿病与心肺疾病的ELP融合蛋白进入I期与II期研究。
   细胞毒性融合蛋白以免疫毒素为核心，来源于细菌或植物毒素，通常分为激活免疫细胞的细胞表面融合蛋白与进入细胞后才发挥活性的融合蛋白两类，毒素组分包括铜绿假单胞菌外毒素A（PEA）、白喉毒素、蓖麻毒素、苦瓜素、颗粒酶B及核糖核酸酶等，一般由细胞结合域、毒素转运域及诱导细胞死亡的催化域组成。除免疫毒素外，免疫激酶融合蛋白可实现肿瘤细胞靶向杀伤而不损伤正常细胞，抗体导向酶前药疗法（ADEPT）则将抗体与外源酶连接，使预先定位于肿瘤部位的酶将前药转化为强效细胞毒性物质，但目前免疫激酶与ADEPT策略的临床研究仍较有限。
   靶向融合蛋白将结合结构域（通常来源于抗体）与治疗效应分子（如细胞因子、酶、信号分子或基因组编辑组件如Cas9）结合，实现特定细胞、器官与组织的局部治疗作用。近期获批的代表性药物包括用于低磷酸酯酶症的组织特异性碱性磷酸酶Strensiq^?，以及用于转移性葡萄膜黑色素瘤的双特异性抗体Tebentafusp-tebn。细胞穿透肽（CPP，如TAT与penetratin）是最早的靶向结构域之一，可实现非侵入性细胞内递送并提升内涵体逃逸效率；肝素结合域（HBD）对高表达硫酸乙酰肝素的细胞（如过表达HER2/3/4受体的肿瘤细胞）具有高亲和力，但目前HBD融合蛋白的临床试验数据仍有限。上述策略最初为其他治疗性蛋白开发，后被适配应用于L-天冬酰胺酶以解决其半衰期短、免疫原性及肿瘤选择性有限等药理局限。
2. 4.
   L-天冬酰胺酶的融合伴侣
   与其他细菌蛋白类似，L-天冬酰胺酶在血清中半衰期短，易通过肾滤过快速清除，目前主要通过蛋白修饰解决该问题，核心策略包括固定于各类载体或采用融合技术，后者将L-天冬酰胺酶与半衰期更长的蛋白或结构域（如白蛋白、Fc片段、ELP或XTEN）融合，也可将肿瘤细胞表面特异性蛋白作为抗体-药物偶联物的靶点。
   4.1 提升L-天冬酰胺酶溶解度与表达的分子标签
   为便于纯化，多数L-天冬酰胺酶表达时会带有C端六组氨酸（His）标签，此外也常用FLAG与Strep II亲和标签。但这些标签可能影响L-天冬酰胺酶的表达水平与溶解度，因此通常联合使用增溶标签与亲和标签。提升溶解度的标签包括