SIX9 基因在尖孢镰刀菌草莓专化型（Fusarium oxysporum f. sp. fragariae，Fof）生长及致病性中的功能研究

《Journal of Fungi》：Involvement of SIX9 in Growth and Pathogenicity in Fusarium oxysporum f. sp. fragariae

　　

草莓是重要的经济作物，在世界范围内广泛种植。尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）属于尖孢镰刀菌种复合群（Fusarium oxysporum species complex，FOSC），广泛存在于植物中，其中尖孢镰刀菌草莓专化型（Fusarium oxysporum f. sp. fragariae，Fof）是草莓上最重要的病原菌之一，对草莓寄主具有致病专化性。近年来由Fof引起的病害严重威胁草莓产业。分泌至木质部（Secreted in Xylem，SIX）基因在F. oxysporum中发挥重要且多样的作用。研究人员对Fof中SIX9基因进行敲除以分析其功能。ΔFofSIX9（即SIX9缺失突变株）的菌丝生长速率显著低于野生型，但产孢量差异不显著。ΔFofSIX9对四个不同代表性草莓品种的致病力显著降低，表现为植株萎蔫、根腐及冠腐程度减轻。此外，与野生型侵染相比，ΔFofSIX9侵染植株中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和过氧化氢酶（catalase，CAT）活性显著升高，而丙二醛（malondialdehyde，MDA）、过氧化氢（H2O2）及超氧阴离子（O2?）含量显著降低。因此ΔFofSIX9可通过影响寄主植物对Fof侵染的防御反应来削弱野生型的致病性。

论文解读：SIX9 在尖孢镰刀菌草莓专化型（Fusarium oxysporum f. sp. fragariae，Fof）生长及致病性中的功能研究

本研究发表于《Journal of Fungi》。草莓是我国及全球广泛栽培的重要经济作物，由尖孢镰刀菌草莓专化型（Fusarium oxysporum f. sp. fragariae，Fof）引起的草莓枯萎病可造成植株维管束萎蔫、根腐和冠腐，严重威胁草莓生产。F. oxysporum 的宿主范围与专化性由其致病相关基因组区域上的基因决定，其中分泌至木质部（Secreted in Xylem，SIX）基因编码的效应子（effector）在真菌—植物互作中起关键作用。此前对不同专化型中 SIX1、SIX4、SIX5、SIX6 等功能已有报道，但 Fof 中 SIX 基因的研究较少，尤其 SIX9 在 Fof 中的功能尚未见系统报道。为此，研究人员以 Fof 野生型菌株 H6 为材料，通过同源比对鉴定 Fof 中 SIX9 同源基因 Fof16561，构建其敲除突变体 ΔFof16561（即 ΔFofSIX9），系统分析 SIX9 缺失对菌丝生长、产孢、非生物胁迫敏感性、对四个草莓品种致病力及对草莓植株抗氧化系统和渗透调节物质的影响，以明确 SIX9 在 Fof 生长及致病性中的作用。

主要关键技术方法：

研究人员选用已鉴定的 Fof 野生型菌株 H6，通过双接头（double?joint，DJ）PCR 扩增 Fof16561（SIX9 同源基因）上下游同源臂及潮霉素 B 磷酸转移酶（hygromycin B phosphotransferase，HPH）筛选标记 cassette，融合后采用聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）介导的原生质体转化法获得 SIX9 缺失突变体 ΔFof16561，并以 PCR 验证。通过测量不同培养基上菌落直径分析菌丝生长速率，显微计数测定产孢量及孢子萌发率，在添加刚果红、KCl、SDS、葡萄糖和 NaCl 的培养基上评估非生物胁迫敏感性。采用根浸接种法和冠部针刺喷雾接种法对四个草莓品种（Fenyu、Black Pearl、Lifeng、Yuexiu）进行致病力测定并计算病情指数。接种后于侵染早期（1 d）、中期（7 d）和晚期（14 d）取草莓叶片测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（peroxidase，POD）、CAT 活性，以及 MDA、H₂O₂、O₂^?、可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量，采用 ANOVA 及 LSD 法进行差异显著性分析。

3.1. SIX 同源基因进化树分析

研究人员基于不同寄主专化型 F. oxysporum 中 SIX9 基因序列进行同源性比对与系统发育分析，发现 Fof 中的 Fof16561 与棕榈、番茄、洋葱、康乃馨及水仙专化型中 SIX9 聚为一支，亲缘关系密切，据此确认 Fof16561 为 Fof 中的 SIX9 同源基因。

3.2. Deletion of Fof16561 in Fof

研究人员利用同源重组替换策略，以 HPH cassette 置换 Fof16561 开放读码框，经 PEG 介导原生质体转化筛选获得 ΔFof16561 缺失突变体，PCR 鉴定显示靶基因被正确替换，证实 SIX9 敲除突变体构建成功。

3.3. Growth, Spore Production, and Spore Germination of ΔFof16561

菌落形态观察显示 ΔFof16561 与野生型 H6 相似，均为平展、边缘整齐、表面淡紫色、边缘白色。但 ΔFof16561 在 PDA、CM、MM 和 OA 四种培养基上的菌丝生长速率分别为野生型的 0.91、0.93、0.94 和 0.97 倍，均显著低于野生型；而产孢量及各时段孢子萌发率与野生型相比无显著差异。表明 SIX9 对 Fof 菌丝生长有正向作用，但不参与孢子产生及萌发过程。

3.4. Effect of Abiotic Stress on ΔFof16561

在非生物胁迫实验中，ΔFof16561 对刚果红（细胞壁/酸胁迫）、KCl（盐胁迫）和 SDS（细胞膜胁迫）的敏感性显著低于野生型 H6（生长抑制率更小），而对葡萄糖（营养胁迫）和 NaCl（渗透胁迫）的响应与野生型无显著差异。提示 SIX9 缺失轻微影响真菌对某些胞外胁迫的响应，但 SIX9 并非主要的逆境应答基因。

3.5. Effect of ΔFof16561 on Pathogenicity

研究人员对四个草莓品种分别进行根浸接种和冠部接种评估。结果显示：品种 Fenyu 根接种致病力下降但未达显著水平，冠接种植株萎蔫、冠腐和根腐病情指数分别降至野生型的 0.70、0.67 和 0.43 倍且具显著性；品种 Black Pearl 根接种和冠接种各部位病情指数均显著下降至野生型的 0.08–0.53 倍；品种 Lifeng 根及冠接种大部分指标显著下降（冠接种根腐无显著差异）；品种 Yuexiu 根及冠接种植株萎蔫和冠腐显著下降（根腐无显著差异）。综上，SIX9 敲除使 Fof 对供试草莓品种的致病力普遍显著降低，且在冠部接种方式中减弱效应更为明显，说明 SIX9 是 Fof 发挥完全致病力的重要效应基因。

3.6. Effect of ΔFof16561 on Resistant Responses of Strawberry Plants

接种后动态检测草莓叶片生理指标发现：侵染早、中期（1 d、7 d）ΔFof16561 侵染植株 SOD 和 CAT 活性显著高于野生型侵染植株，晚期（14 d）有所变化但趋势各异；POD 活性在野生型侵染中后期显著高于 ΔFof16561 和对照。MDA 含量在野生型侵染中、晚期显著高于 ΔFof16561 侵染和对照，说明野生型诱导更强的膜脂过氧化。H₂O₂和 O₂^?含量在野生型侵染晚期也显著高于 ΔFof16561 侵染组。可溶性糖和脯氨酸在 ΔFof16561 侵染早期较高，中期后野生型侵染组升高更明显；可溶性蛋白在野生型侵染晚期最高。结果表明，ΔFofSIX9 因丧失 SIX9 效应子功能，不能像野生型那样有效抑制或操纵寄主的抗氧化防御反应，使寄主 SOD 和 CAT 清除活性氧（reactive oxygen species，ROS）能力增强、膜损伤减轻，从而导致致病力下降。

讨论与结论总结：

研究人员指出，本研究首次在 Fof 中鉴定并敲除 SIX9 同源基因 Fof16561，证实 SIX9 参与调控 Fof 菌丝生长速率但不影响产孢与萌发，对酸、盐和表面活性剂类非生物胁迫敏感性仅有轻微影响。致病试验表明 SIX9 是 Fof 发挥完全致病力所必需的效应基因，其缺失显著降低对不同草莓品种及不同侵染部位（根腐、冠腐、植株萎蔫）的致病程度。生理生化检测显示，野生型 Fof 通过 SIX9 效应子干扰或抑制草莓植株的 ROS 清除系统（SOD、POD、CAT），诱导 MDA、H₂O₂和 O₂^?积累及膜脂过氧化，从而利于定殖与扩展；而 ΔFofSIX9 无法引发同等强度的寄主防御抑制，植株抗氧化酶活性较高、氧化损伤较轻，病害减轻。研究结论为：SIX9（Fof16561）在尖孢镰刀菌草莓专化型中介导菌丝生长并促进致病性，其通过调控寄主植物防御与活性氧平衡参与 Fof–草莓互作，为深入理解 F. oxysporum SIX 效应子在专化型致病机制中的作用及草莓枯萎病的分子防控提供了理论依据。