小鼠适应性柯萨奇病毒A16感染模型中的神经嗜性与干扰素主导型免疫应答

《Journal of Virology》：Neurotropism and interferon-dominated immune responses in a mouse-adapted coxsackievirus A16 infection model

　　

动物模型感染柯萨奇病毒A16（Coxsackievirus A16, CVA16）的研究受限于神经毒力（neurovirulence）不足，这阻碍了发病机制研究及抗病毒药物评估。因此，研究人员旨在建立新生ICR（Institute of Cancer Research）小鼠CVA16感染模型，通过从2日龄ICR哺乳小鼠中连续传代感染脑组织，获得高神经毒力的小鼠适应性毒株（CVA16-P5），以建立抗病毒评估的最佳感染条件。通过系统优化病毒剂量、接种途径和感染日龄，研究人员确定了能够可重复诱导进行性神经系统疾病和多系统受累的条件。CVA16-P5毒株感染导致多组织出现一致性病理改变，并伴有特征性神经表现。神经组织的转录组学分析揭示了组织特异性的干扰素主导型免疫应答及系统性病毒播散的特征，重现了严重人类感染的关键特征。全基因组测序鉴定出VP1衣壳蛋白中与鼠适应性增强神经毒力相关的非同义突变。总体而言，该CVA16-P5适应性毒株感染模型为研究CVA16致病机制和临床前评价抗神经嗜性肠道病毒（enterovirus）疫苗及抗病毒药物提供了可靠的实验平台。

该研究由Huijie Li、Rui Wang等人完成，发表于《Journal of Virology》，旨在解决CVA16神经致病机制研究中缺乏可靠动物模型的瓶颈问题。CVA16是手足口病（Hand, Foot, and Mouth Disease, HFMD）的主要病原体之一，在亚太地区5岁以下儿童中造成重大公共卫生负担。虽然历史上CVA16与严重神经系统疾病的关联性低于肠道病毒A71（Enterovirus A71, EV-A71），但越来越多的临床报告表明CVA16感染可伴随脑干脑炎、无菌性脑膜炎和急性弛缓性麻痹等严重神经系统并发症，部分病例甚至出现长期神经系统后遗症。CVA16分子流行病学显示复杂进化模式，VP1衣壳区存在主要中和表位，其遗传可塑性为疫苗开发带来挑战。此外，与其他肠道病毒的共同循环和共感染可能促进具有改变毒力特性的新型重组株出现。

现有动物模型主要依赖转基因小鼠和免疫缺陷小鼠。表达人病毒进入受体的转基因小鼠（如清道夫受体B类成员2（Scavenger Receptor Class B Member 2, SCARB2）和P-选择素糖蛋白配体-1（P-selectin Glycoprotein Ligand-1, PSGL-1）转基因小鼠）虽为研究病毒-受体相互作用提供平台，但通常需经颅内接种，绕过外周感染途径，无法完全重现HFMD的临床表型。免疫缺陷小鼠模型因免疫系统受损而限制了完整宿主免疫应答的研究。人源化小鼠模型虽具前景，但技术复杂且成本高。相比之下，新生ICR小鼠模型对肠道病毒感染高度易感，具有成本低、病毒载量和疾病进展一致等优势，但CVA16在该模型中的应用研究仍然有限。因此，建立能够重现CVA16神经嗜性和系统性病理的免疫正常动物模型，对于阐明神经入侵机制和评估抗病毒策略具有重要科学意义。

研究人员采用连续体内传代策略，从2日龄ICR小鼠脑组织中逐步筛选获得CVA16-P5高神经毒力适应株，并系统优化病毒剂量（10³–10⁶ TCID₅₀/50 μL）、接种途径（腹腔、颅内、肌肉）和感染日龄（2、4、6、8日龄），最终确定肌肉接种10⁶ TCID₅₀/50 μL于2日龄小鼠为最佳感染条件。通过组织病毒滴度测定、组织病理学分析、免疫组织化学染色、尼氏（Nissl）染色、免疫荧光及TUNEL凋亡检测、转录组测序（RNA-seq）及生物信息学分析、全基因组测序与结构建模、反向遗传学构建重组病毒，以及病毒附着和内化实验等技术方法开展研究。所用原始CVA16毒株HB10-114分离自2010年5月12日中国河北省一名轻症手足口病患者的咽拭子样本。

**一、新生ICR小鼠CVA16感染模型的建立**

通过将CVA16原始毒株（P0）在2日龄ICR小鼠体内连续传代5代，获得小鼠适应性CVA16-P5毒株。与低代次毒株相比，高代次毒株感染的小鼠疾病更为严重，P5代毒株感染导致体重增长减缓、存活率下降和临床评分升高，包括更早出现肢体无力和瘫痪。剂量范围实验显示，10⁶ TCID₅₀/50 μL剂量可致快速疾病进展：3日出现肢体无力，5–6日瘫痪，7日全部死亡；10⁵和10⁴ TCID₅₀/50 μL剂量延迟发病；10³ TCID₅₀/50 μL仅致轻度表现。接种途径比较显示，肌肉注射产生最可复制的疾病动力学（约5日发病，7–8日死亡），优于腹腔注射（变异大）和颅内注射（虽一致但属人工途径）。日龄依赖性实验表明，2日龄小鼠完全死亡，4日龄约50%死亡率，6和8日龄仅短暂体重下降后恢复，显示强烈的日龄依赖性易感性。2日龄感染小鼠表现出明显神经症状，包括活动减少、共济失调、嗜睡和弛缓性肢体麻痹，可见单侧和双侧肢体瘫痪。

**二、CVA16感染小鼠的系统性病理表现**

组织病毒滴度测定显示，病毒滴度随时间增加，骨骼肌滴度最高，其次为肺组织；脑和脊髓可检测到约10⁴ TCID₅₀的病毒载量；肝脏和肾脏滴度渐进性升高。组织病理学分析显示多器官受累：脊髓前角区神经元空泡化和排列紊乱；海马神经元排列紊乱、胞体萎缩、核固缩和神经元密度降低；骨骼肌纤维紊乱和细胞变性；肺泡间隔增厚和肺泡内渗出；心肌纤维紊乱和局灶性炎症细胞浸润；肝细胞变性和局灶性结构损伤；脾脏正常结构破坏；肾小球结构改变。半定量病理评分显示骨骼肌和肺组织评分最高，肝脏和肾脏相对较轻。免疫组织化学检测发现，CVA16抗原在骨骼肌中表达最为一致，肺、脊髓和脑中有弱或局限性信号，其他组织信号稀疏，表明骨骼肌是主要病毒复制部位，其他组织的病毒播散主要由病毒滴度数据支持。

**三、CVA16感染诱导的神经嗜性和神经病理改变**

神经病理学分析显示，脊髓Nissl阳性神经元数量减少，神经元胞体皱缩、Nissl物质减少；脑组织Nissl阳性神经元同样减少。神经元标志物免疫荧光显示，脊髓中HuC/D和NeuN信号强度和分布模式改变， NeuN荧光强度归一化至HuC/D后出现显著变化；脑组织中NeuN免疫反应性显著低于对照组。TUNEL凋亡检测显示，脑组织中TUNEL阳性细胞增加，与NeuN标记细胞部分空间重叠，表明神经元凋亡增加；脊髓中未观察到显著增加。脑组织中NeuN荧光强度归一化至DAPI后显著降低，TUNEL阳性细胞百分比显著升高，提示脑组织神经元丢失和损伤更为显著。

**四、转录组学分析揭示CVA16感染后神经组织的分子改变**

RNA-seq分析显示广泛的差异基因表达。脊髓中1,732个基因上调、1,053个下调，脑中1,241个上调、987个下调；脊髓基因表达变化幅度更大（最大log₂倍数变化8.7 vs. 6.4）。基因本体论（Gene Ontology, GO）富集分析显示，脑和脊髓差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）均富集于免疫和抗病毒应答相关生物学过程，包括先天免疫应答、干扰素介导的信号传导和炎症反应；细胞组分主要涉及细胞膜、细胞质和胞外区域；分子功能涉及蛋白结合、主要组织相容性复合体（Major Histocompatibility Complex, MHC）结合和GTP酶活性。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路分析鉴定出吞噬作用、NOD样受体信号传导、抗原加工与呈递及病毒感染相关通路的富集。脊髓组织差异表达基因数目和变化幅度均大于脑组织，提示脊髓具有独特的免疫应答特征。

**五、VP1_HI-环结构域E241K突变与鼠适应性毒力增强相关**

全基因组测序鉴定出两个核苷酸变异：VP3编码区1717位点的同义突变（无氨基酸改变），以及VP1基因3616位点的非同义突变，导致241位谷氨酸变为赖氨酸（E241K）。序列比对显示，该位点位于VP1的HI-环（HI-loop）区域，为病毒衣壳表面暴露区。该突变在P0–P3中不存在，P4出现并保留至P5，与P4部分死亡、P5完全死亡的表型渐进增强相一致。三维结构建模显示，241位残基位于VP1暴露的HI-环中，谷氨酸替换为赖氨酸后局部电荷性质改变。

**六、VP1_E241K替换与病毒内化效率、复制能力及疾病严重程度增强相关**

研究人员通过反向遗传学构建携带E241或E241K的重组CVA16病毒进行功能验证。体内实验显示，与E241病毒相比，E241K病毒感染小鼠体重损失更大、存活率更低、临床评分更高。一步生长曲线分析显示，E241K病毒感染细胞中病毒RNA水平和感染性滴度均持续高于E241病毒。病毒附着实验显示，两病毒在细胞相关病毒RNA水平和感染性滴度上无显著差异，表明附着效率相当。病毒内化实验显示，E241K突变病毒在多个时间点的细胞内病毒RNA水平和感染性滴度均显著高于E241病毒，表明该突变影响内化阶段而非附着阶段。

**讨论与结论总结**

研究人员建立的CVA16-P5新生小鼠感染模型重现了严重人类C24A16感染的关键特征，包括进行性肢体麻痹和致死性神经结局。肌肉接种10⁶ TCID₅₀/50 μL提供了可复制且一致的疾病进程，允许病毒从外周组织播散至中枢神经系统，避免了直接颅内注射的人工效应，提高了生理相关性。模型表现出日龄依赖性易感性，支持其在实验研究中的实用性。

鼠适应性P5毒株在连续体内传代中获得两个结构蛋白突变：VP3同义突变和VP1_E241K非同义突变。结构分析提示，位于VP1暴露环区的E241K突变可能影响病毒进入或早期复制过程。反向遗传学验证直接证明了该替换的功能相关性：E241K突变病毒在体外增强病毒进入（内化阶段）和复制效率，不影响病毒附着；在新生小鼠中引起更严重的疾病表现。这些发现证明VP1_E241K替换与鼠适应性过程中毒力增强强烈相关。

组织病理学和免疫组织化学分析揭示了感染后的广泛组织受累，骨骼肌、肺和中枢神经系统出现显著病理改变。虽然神经组织中病毒抗原免疫检测相对有限，但病毒RNA存在、神经病理改变和持续性临床麻痹共同支持神经系统的活动性感染。脊髓组织的显著受累与严重CVA16患者的运动缺陷一致。转录组分析显示脑和脊髓组织中均有显著的干扰素主导型免疫特征，脊髓中差异表达基因数目和变化幅度更大，提示脊髓具有独特的免疫应答特征，可能与运动通路优先受累有关。干扰素刺激基因、先天免疫通路和抗原呈递机制的富集提示了神经组织中抗病毒防御机制的 robust 激活，但过度或持续的干扰素信号也可能参与免疫介导的神经病理学。脑组织表现出更明显的神经元标志物信号降低和凋亡细胞增加，提示神经元丢失和损伤更为显著。

该研究为CVA16致病机制提供了新视角。CVA16仅在ICR小鼠中连续传代5次后就表现出严重神经毒力，表明CVA16在选择压力下具有快速适应能力。VP1-E241K替换的鉴定提示该残基是适应性进化的潜在热点，值得进一步研究其在病毒适应和致病性中的作用。脊髓组织中显著的干扰素应答强调了先天免疫在神经嗜性病毒感染中的双重作用，既是保护因素也是潜在致病因素，与严重儿科病例的临床观察一致。

该模型与转基因受体敲入模型具有互补实验目的：后者适用于评估不同流行CVA16临床分离株，而该标准化鼠适应性毒株模型在一致宿主背景下为抗病毒筛选和神经毒性病毒决定因素鉴定提供了可重复平台。该模型也存在局限性：仅2日龄小鼠呈现稳定致死表型，限制了更广泛应用；肌肉接种绕过了肠道病毒自然黏膜传播途径；极端疾病严重程度可能限制其用于疫苗评估。

研究结论为：该研究建立了具有免疫正常宿主背景的可重复的新生小鼠严重CVA16感染模型，并鉴定了与神经毒力增强相关的关键VP1突变。该CVA16-P5适应性毒株感染模型为理解CVA16致病机制和临床前评价抗神经嗜性肠道病毒疫苗及抗病毒药物提供了宝贵的实验平台。