《BioDesign Research》：Advances in Prime Editing: Molecular Innovations, Large-Fragment Engineering, and AI-Driven Design
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先导编辑（Prime Editing, PE）已迅速发展成为一种多功能、高精度的基因组工程技术，能够在无需双链断裂（Double-Strand Break, DSB）或外源供体DNA模板的情况下，实现靶向碱基替换、插入及缺失修饰。自该技术问世以来，研究人员通过
先导编辑（Prime Editing, PE）已迅速发展成为一种多功能、高精度的基因组工程技术，能够在无需双链断裂（Double-Strand Break, DSB）或外源供体DNA模板的情况下，实现靶向碱基替换、插入及缺失修饰。自该技术问世以来，研究人员通过对核心组件的迭代创新取得了实质性进展，涵盖Cas蛋白变体、逆转录酶（Reverse Transcriptase, RT）工程改造及先导编辑向导RNA（prime editing guide RNA, pegRNA）设计优化。这些改进显著提升了跨不同生物系统的编辑效率、保真度及靶标可及性。与此同时，TwinPE、PASTE及PrimeRoot等大片段编辑平台的开发，将先导编辑的应用范围从小序列修饰拓展至千碱基级基因组重写。此外，人工智能驱动的设计工具与先导编辑技术的融合，变革了pegRNA优化及系统选择流程，使得编辑结果更具可预测性与高效性。本综述全面概述了推动先导编辑演进的最新分子创新、大片段编辑策略及计算方法。综上，这些发展使得先导编辑成为一个高度可编程且可扩展的平台，在医学、农业及合成生物学领域具有广阔的应用前景。
引言
先导编辑（PE）是当前最先进的基因组编辑技术之一，其特点是在不引入双链断裂或依赖外源供体DNA模板的前提下，实现靶向碱基替换、插入和缺失。该系统于2019年首次推出，随后通过多种变体的开发得到了广泛优化，这些变体对其核心组件进行了修饰，包括Cas切口酶、逆转录酶（RT）、先导编辑向导RNA（pegRNA）以及用于偏向DNA修复结果的辅助切口策略。第一代版本PE1将野生型莫洛尼小鼠白血病病毒（Moloney Murine Leukaemia Virus, M-MLV）RT与SpCas9(H840A)切口酶融合，建立了初始机制，但仅表现出中等效率，提示RT活性较低。PE2通过引入设计的突变以增强RT持续合成能力，显著提高了编辑效率。PE3在非编辑链上引入第二个切口，提升了编辑率但也增加了插入缺失（indel）形成；为此开发的改良版PE3b策略通过确保第二个切口仅在编辑成功整合后发生，减少了副产物。随着领域的发展，PE4和PE5被开发出来，其中PE5结合了MLH1dn介导的错配修复抑制以提高产物纯度。密码子优化的PEmax平台进一步提升了表达与稳定性，而其精简版本PEmini则适用于具有严格尺寸限制的病毒递送系统。除已确立的PE1-PE5架构及其后续优化变体外，领域内还提出了若干概念性延伸，旨在通过增强DNA修复通路调控及整合编辑优化策略进一步提升先导编辑性能，部分研究中将其称为PE6和PE7，但这些命名尚未被广泛采纳，目前不代表与PE2、PE3、PE4、PE5、PEmax、TwinPE或PASTE相当的标准化架构，应被视为概念框架或研究特异性命名。除蛋白组件外，研究人员还致力于RNA设计，包括将pegRNA改造为稳定变体（epegRNA）、多模板pegRNA及双pegRNA，以提升效率和实现更复杂的编辑。此外，通过开发更长PAM识别形式的Cas蛋白（如SpCas9-NG和SpG）及更小尺寸的蛋白（如SaCas9和Cas12f），拓展了靶标范围和递送可能性。这些优化使得先导编辑能够在哺乳动物细胞、植物、微生物及模式生物等多种生物体系中发挥作用。随着编辑应用延伸至长程替换、外显子替换及调控重布线，TwinPE、PASTE和PrimeRoot等方法填补了短片段精准编辑与大功能编辑之间的空白。计算设计工具与PE技术协同发展，pegRNA设计、Cas变体选择及修复结果模拟现可通过人工智能辅助预测工具完成，减少了需要实验评估的候选pegRNA数量，尽管这一效益在不同研究和生物系统中存在差异。这些发现共同使得先导编辑成为一个能够对基因组序列进行可编程、精准编辑的灵活系统。
先导编辑系统的多层功能框架
为统一解析快速发展的先导编辑技术格局，本文提出一个多层功能框架，将编辑结果的关键决定因素整合为四个相互作用的层级：酶层、RNA层、DNA修复层和染色质环境层。酶层由Cas和逆转录酶模块的变体组成，决定了系统的靶向范围、催化效率及生化能力，负责编辑的定位与效率，以及逆转录的起始与延伸。RNA层编码pegRNA，包含引物结合位点（PBS）、逆转录模板（RTT）及结构稳定元件，负责承载编辑信息并控制杂交动力学、模板可及性及整体编辑精度。编辑中间体的命运及预期编辑是否被保留或清除取决于DNA修复层的结构，仅改变酶或RNA对编辑的影响有限，因为错配修复、 flap 分辨率及连接动力学等过程主导了最终结果。染色质层代表了经典调控之外的另一层关键调控，相较于游离DNA底物，基因组靶标与染色质结构相关联，允许或阻碍编辑机器的接近。染色质可及性、核小体定位及高阶基因组组织调控Cas蛋白的初始结合、pegRNA杂交所需的R-loop形成以及逆转录的进行。此外，DNA和组蛋白的翻译后修饰（如DNA甲基化和组蛋白修饰标记）可能改变局部DNA柔韧性并触发因子招募，从而调控编辑效率及DNA修复通路的选择。因此，相同的编辑构建体可能因染色质状态差异在不同基因组区域产生显著差异的结果。重要的是，这四个层级并非模块化独立存在，而是高度相互依赖。优化某一层级可能对其他层级产生约束，例如PAM宽松型Cas变体可拓展靶向范围，但可能导致pegRNA定位改变；同时，若编辑反应中间体优先被修复通路清除，即使提升RT活性也可能无法提高编辑效率；同样，某些有利的pegRNA设计可能在封闭染色质区域失效，染色质可及性和周围表观遗传环境的差异也可能导致对DNA修复通路调控的不同响应。在此背景下，先导编辑的效率受限于三个步骤：1）酶和染色质水平的靶向限制；2）RNA和逆转录水平的合成限制；3）DNA修复通路水平的分辨率限制。该多层模型表明，成功的先导编辑需要对所有功能层级进行协同优化，未来的改进将依赖于系统级工程策略而非单个功能组件的改进，这一方法整合了分子设计与染色质环境/修复过程的概念，为可预测、可扩展的基因组编辑提供了起点。
用于先导编辑的Cas变体
Cas蛋白作为先导编辑系统的靶向支架，其变体的演化极大拓展了PE在不同基因组中的可及性、效能及精准度。初始系统采用SpCas9(H840A)切口酶，其编辑位置受限于刚性的NGG原型间隔序列邻近基序（Protospacer-Adjacent Motif, PAM）。为克服这一限制，PE适配了多种PAM宽松化变体：SpCas9-NG能够识别NGN PAM，实现了靠近非NGG位点的致病突变编辑；定向进化方法获得的SpG和SpRY进一步放宽了PAM限制，其中SpRY接近PAM非依赖性活性，大幅拓展了靶标位点范围，这对精准定位pegRNA引物结合位点（PBS）和RTT至关重要，尤其在临床相关基因中PAM可用性有限的情况下。同时，PE架构整合了高保真Cas变体，如HF1、HypaCas9和eSpCas9衍生物，在效率损失最小的情况下降低了脱靶效应，这一特性在治疗场景中尤为重要，可减少低频脱靶切口及非预期的修复事件和插入。为解决SpCas9的递送限制，研究人员探索了紧凑型Cas蛋白：SaCas9(H587A)切口酶能够将先导编辑器包装至单腺相关病毒（Adeno-Associated Virus, AAV）载体，避免了SpCas9构建体的尺寸限制；Cas12f（Cas14）和CasX（Cas12e）尺寸极小，但其与RT域的融合仍需针对尺寸考量和催化异常进行优化。PE系统还整合了经修饰的Cas变体以改善DNA结合动力学，延长DNA滞留时间的工程化Cas变体可通过延长编辑窗口提升逆转录效率；通过结构域改变或包含染色质修饰肽来增强染色质可及性的变体，有助于在致密包装的基因组区域实现编辑。另一重要类别是split-Cas系统，如split-Cas9和split-RT，可实现模块化递送，通过将Cas9切割为两个可在细胞内组装的片段，克服了递送载体的尺寸限制，并可通过split-intein系统实现组织特异性方法，有效减少全身暴露于活性Cas蛋白。在Cas9衍生物中，尝试将Cas12a与先导编辑关联也显示出有前景的功能，尽管其在PAM识别和切割方面存在结构差异：Cas12a的TTTV PAM可进入更富含AT的基因组区域，其交错切割特性支持与切口酶工程结合的混合策略以校正RT引发。尽管基于Cas12a的PE目前效率有限，但通过优化pegRNA设计、接头几何结构及RT融合取向，有望使其在AT富集基因组中具有实用性。综上，Cas蛋白的多样性使得先导编辑成为可根据基因组背景、疾病治疗及递送限制进行定制的工具，未来发展预计将聚焦于专门为先导编辑优化的Cas变体工程，强调flap形成的便利性、与pegRNA-DNA杂交物的相互作用改善，以及调节DNA结合动力学以帮助规划高效的多步编辑反应，这些进展主要增强了多层框架中的酶层，拓展了靶向范围、催化效率及基因组可及性。
逆转录酶（RT）变体
先导编辑依赖逆转录酶域以pegRNA为模板合成编辑后的DNA序列。早期系统（如PE1）使用野生型莫洛尼小鼠白血病病毒（MuLV）RT，其缺点是对长插入的处理效率中等，且会产生截短的延伸产物。为增强聚合酶活性、热稳定性及模板亲和力，PE2引入了D200N、V223A、S228K、M229V和K363N等稳定突变，这些突变显著提升了RT性能，使其能够轻松延伸PBS并在不同基因组环境中实现RT延伸。这一改良版RT被用于PE3、PE3b及PEmax等后续版本。进一步的工程改造产生了具有更高链置换能力的RT变体，降低了提前终止率，支持更长RTT序列的有效编辑。模板修饰增强了RT与DNA-RNA融合物的结合稳定性并提升了编辑效率，该工程策略在大于100-1000核苷酸的插入中表现尤为突出，此前这类插入因RT解离而效率低下。PE4和PE5通过调节错配修复来协同提升RT性能，利用MLH1dn阻断修复通路以稳定修饰中间体。除PE4和PE5系统中使用的显性负性MLH1策略外，近期研究探索了调节错配修复通路的其他方法，例如通过计算蛋白质设计方法开发了靶向MLH1的小蛋白结合剂，可在编辑过程中瞬时干扰MLH1活性，从而减少错配修复机制对编辑中间体的校正，在维持DNA修复通路可控调节的同时增强预期编辑的整合。这些系统中的改良RT变体使得编辑产物在新生合成碱基被错配修复移除前能够稳定整合到基因组中，这对在MMR功能正常的细胞类型中校正致病等位基因起到了关键作用。尽管部分研究探索了PE5之后的概念延伸（包括被称为PE6和PE7的系统），但这些命名仅限于特定实验报告，尚未构成被广泛采纳的先导编辑平台，应被解读为新兴概念框架而非既定架构。拟议的改进聚焦于提升逆转录酶性能、优化pegRNA设计及调节DNA修复通路，但尚未在不同细胞类型或实验背景下得到广泛验证。PEmax通过配对RT改进与表达及核定位信号优化进一步提升了编辑效率；PEmini作为更小的形式，去除了非必需的RT序列以减小基因货物尺寸，同时保持催化活性，支持AAV载体使用。特定RT变体与pegRNA二级结构的相互作用更有效，减少了停滞并支持在TwinPE、PASTE和PrimeRoot等高级系统中使用长RTT。新型类别包括模块化RT，其结构组件可通过替代Cas支架进行重构以优化几何构象。另一个决定先导编辑效率的结构因素是接头架构（Linker Architecture, LA），涉及Cas9切口酶与逆转录酶域的连接，接头的灵活性和长度可影响逆转录酶相对于DNA底物和pegRNA模板的空间定位，优化接头架构可能改善逆转录效率并稳定编辑复合物。RT活性位点相对于置换DNA链的 positioning 可通过优化定制接头实现。这种模块化特性支持与其他Cas变体（如SaCas9或Cas12f）的整合。研究还探索了融合DNA结合或修复调节肽的RT变体以促进有效flap分辨率，影响5′-flap移除、3′-flap保护及连接酶动力学的RT变体可能显著提升产物质量并拓展可能的编辑范围。高保真RT变体降低了对错误掺入的容忍度，以减少治疗构建体中的副产物，尤其是在需要高序列准确性的场景中。下一阶段RT工程预计将采用机器学习指导的蛋白质设计和定向进化，以优化持续合成能力、增强错误辨别力，并实现针对特定Cas变体和pegRNA折叠体的结构域级改造。这些下一代RT对于将先导编辑从短序列编辑扩展至大片段及多步基因组编辑工作流程至关重要，进一步通过提升逆转录效率、持续合成能力及与不同编辑背景的兼容性来完善酶层。
pegRNA变体创新
在多层级框架中，这些创新代表了RNA层的关键优化，负责模板编码、杂交动力学及编辑精度调控。作为调控先导编辑的RNA组件，pegRNA是多功能的RNA分子，既能结合Cas蛋白又能编码逆转录生成的RNA模板。初始pegRNA设计将PBS和RTT整合到sgRNA支架中，支持PE1和PE2系统中的早期编辑反应。然而，3′端的此类无结构延伸易发生降解和错误折叠，限制了大多数基因组应用中的效率。这些限制推动了稳定化pegRNA（包括epegRNA）的设计，其包含稳定RNA基序（如evoPreQ1或xrRNA）以保护RTT区域。近期研究通过整合xrRNA等结构化RNA基序进一步提升了pegRNA稳定性，证实在pegRNA 3′端插入xrRNA基序可保护RNA免受核酸外切酶降解，延长细胞内半衰期并增强先导编辑效率。这些携带xrRNA基序的pegRNA（xr-pegRNA）通过维持RTT区域的完整性提升了编辑产量，并在长模板需求或细胞内RNA周转率高的情况下实现更有效的逆转录。epegRNA在多种细胞类型中提升了编辑率，尤其是针对较长RTT的场景。pegRNA的进一步优化包括根据上下文调整PBS和RTT设计，研究发现PBS长度必须根据熔解温度、GC含量及局部序列特征进行调整，RTT设计需要考虑可能干扰RT持续合成能力的二级结构和折叠相互作用。为缓解这些限制，研究人员制定了pegRNA设计的系统化规则，提升了可预测性和灵活性。多模板PE进一步拓展了PE活性至其他引发模式，单个RNA分子即可实现。具有多个结合位点的pegRNA或多PBS增强了引发的多功能性，支持在难以杂交的区域进行引发。多RTT pegRNA能够从单个靶序列产生多个编辑产物，近期技术进步还通过重构pegRNA模板区域以增强逆转录模板的可及性，并通过展开可编辑序列空间来实现多功能模板RNA架构设计，这在基于核酸酶的先导编辑中尤为有用，可有效利用模板并精准控制修复过程，从而提升编辑效率并拓展靶标兼容性。这允许同时测试突变或产生互补基因型。多种特化pegRNA衍生物支持非经典编辑策略，其中临时序列阻滞阻止RTT杂交直至Cas结合，使其通过RNA二级结构动力学被降解或解析。为实现大片段规模编辑，可通过双pegRNA编码的RTT互补序列在两个方向上延伸RT，这些双架构被用于构建TwinPE、PrimeRoot和PASTE等系统，双pegRNA可形成重叠的DNA flap，进而融合形成插入或替换，实现远超单pegRNA的编辑规模。改良的pegRNA支架还包含可招募次级因子至编辑位点的蛋白结合位点，除结构稳定策略外，还考虑了其他转录系统以增强pegRNA的功能性和表达，值得注意的是，由RNA聚合酶II（Pol II）表达的工程化pegRNA允许在细胞中进行灵活、受控的表达，这些系统可将pegRNA整合到更长转录本中，随后被切割为功能片段，支持多重编辑并提供比传统Pol III系统更精确的转录表达调控。该技术拓展了先导编辑的范围，实现了对转录的精准控制及与原生转录程序的整合。其他pegRNA可同时结合MCP和PP7外壳蛋白，这些蛋白已与染色质调节因子或修复蛋白融合以重塑编辑微环境。作为靶向小分子RNA层面的方法，microRNA或小分子响应性pegRNA也可作为编辑工具，实现治疗可控、细胞类型特异性的编辑。化学修饰pegRNA（如添加2′-O-甲基或硫代磷酸酯基团以增强pegRNA对核糖核酸酶降解的抗性）的开发提升了pegRNA稳定性，改良的pegRNA增强了原代细胞和体内编辑效果，在这些场景中RNA稳定性通常是瓶颈。RNA工程加剧了pegRNA设计的多样性，对拓展先导编辑范围至关重要。未来技术将结合多模板灵活性、结构稳定性及上下文敏感激活的pegRNA设计，以实现对多样靶标的高效编辑，不仅包括大片段插入，还包括复杂序列编辑。
切口与成对向导变体
这些策略主要作用于DNA修复层，偏向修复通路并影响编辑中间体的分辨率。切口策略和成对向导设计在定义编辑系统效率、链编辑偏向及先导位点修复方面至关重要。原始PE2技术仅使用目标链上的一个切口，未编辑和已编辑的DNA flap处于平衡状态以整合预期改变，尽管PE2不会引起广泛的基因组破坏，但其编辑效率较低。为改进编辑过程，PE3在未编辑链上添加第二个切口，从而偏向编辑链修复，这种双切口方法显著提升了编辑效率，但代价是增加了indel形成。理性设计的PE3b系统进一步优化了该策略，通过调整第二个切口的位置，使其仅在已编辑链成功合成后才发挥作用，从而最小化非预期副产物并显著提升效率。切口控制的进一步进展还包括切口RNA技术，通过创建改变的sgRNA或pegRNA来影响切口形成的时间和幅度，这些方法有助于防止引发非预期修复通路的 unwanted 切口，同时促进切除链的整合。此外，pegRNA掩蔽和错配引发响应通过影响flap稳定性和修复通路响应来调节编辑动力学。这些概念在成对向导技术中得到推广，该技术使用多个向导靶向编辑位点，通过每个位点使用超过一个pegRNA或多个pegRNA拷贝，以更高的特异性和准确性灵活修饰基因组。先进系统如TwinPE使用两个pegRNA，分别结合编码RTT的互补DNA链，在重叠DNA序列中产生长3′ flap，可精确组合成更大片段。成对pegRNA有多种应用，例如确定长程序列中保留或修改的外显子，以及在哺乳动物细胞和植物中插入基因盒。其他变体（如PE3c）通过控制pegRNA与次级切口向导之间的间距来减少副产物，尤其在复杂基因组环境中。其他成对切口方法依赖可编程计时装置实现链的顺序修饰（而非同时修饰），例如通过改变启动子强度或RNA稳定性。除切口-修复系统外，近期还出现了核酸酶与先导编辑器的结合，这些系统兼具更高准确性和效率，通过调节切割活性并激活修复过程，为提升先导编辑效率提供了替代策略。混合系统
