CAdir：基于细胞与基因联合聚类（Joint clustering）的单细胞转录组学方法及可视化驱动的聚类质量评估

《PLOS Computational Biology》：CAdir: Joint clustering of cells and genes for single-cell transcriptomics with visualization-driven cluster quality assessment

　　

摘要：单细胞RNA测序（single-cell RNA-seq，scRNA-seq）的聚类旨在寻找相似细胞并将其分组为具有生物学意义的簇。然而，现有多数聚类算法既不提供定义聚类的标记基因（marker genes），也无法以无监督方式推断数据中聚类的数目，且缺乏便捷工具来判断标签分配的质量。因此，聚类质量通常依赖于目视检查UMAP或t-SNE等降维嵌入（embedding），但这些嵌入可能扭曲真实的聚类结构，且因超参数选择不同而产生显著差异。为提高聚类结果的可解释性，研究人员开发了CAdir（Correspondence Analysis directional clustering），一种可利用对应分析（Correspondence Analysis，CA）诱导的几何结构对细胞及其关联基因按CA空间中的方向进行聚类的算法。CAdir依据聚类方向之间的夹角自动合并与分裂聚类，从而无用户输入地推断数据中的聚类数目。一套完备的诊断与解释性图形使用户能直观判断聚类决策及最终与中间聚类结果的质量。CAdir可扩展至极大数据集，基准测试显示其聚类性能与其他主流单细胞细胞聚类算法相当。CAdir可从GitHub获取：https://github.com/VingronLab/CAdir

论文解读：《PLOS Computational Biology》刊登的CAdir研究表明，针对单细胞RNA测序（single-cell RNA-seq，scRNA-seq）数据的细胞聚类是发现未知细胞类型的重要手段，但目前主流聚类方法存在三方面局限：第一，多数算法无法同时输出定义各聚类的细胞类型特异性标记基因（marker genes），常需事后做差异表达分析，存在"双重挖掘（double-dipping）"统计偏倚；第二，真实实验中细胞类型数目通常未知，而k-means等算法需预设聚类数k，部分图聚类（如Leiden）虽可不预设k但决策过程对用户不透明；第三，聚类质量评价依赖UMAP或t-SNE等非保距非线性嵌入，其超参数敏感且距离不可解释，易误导质量判断。双聚类（biclustering）虽可同时聚类细胞与基因，但现有BackSPIN、CAbiNet等方法或因内存受限难以处理大数据集，或仍依赖UMAP类嵌入做可视化评价。为此，研究人员提出CAdir（Correspondence Analysis directional clustering），利用对应分析（Correspondence Analysis，CA）将细胞与基因嵌入同一低维空间后，沿CA空间中由细胞与标记基因共同张成的方向（direction）进行细胞—基因联合聚类，依据聚类方向间夹角自动分裂与合并以推断最优聚类数，并配套可解释的关联图（Association Plot）用于聚类质量诊断与标记基因排序，且可基于共聚类基因做自动细胞类型注释。

主要关键技术方法：研究人员采用对应分析（CA）对预处理后的scRNA-seq计数矩阵做降维，保留前d维主惯量（通常为30–50维）；以k-means₊₊初始化若干方向向量，通过总最小二乘回归（Total Least Squares via SVD）迭代更新各聚类方向并使细胞按到方向的正交距离最近分配；引入基于随机方向模拟推断的截断夹角（cutoff angle，默认99%分位数），逐轮对聚类做二分试探分裂（夹角大于截断则分裂）与两两合并（夹角小于截断则合并）直至收敛；基因按标准坐标到各聚类方向的投影与正交距离分配至最邻近方向并过滤原点附近管家基因（保留距原点最远的80%），以S-score量化基因簇特异性；利用共聚类基因做超几何检验匹配CellMarker 2.0或PanglaoDB基因集，匈牙利算法一对一注释细胞类型；基准测试使用Splatter包基于PBMC3k与Zeisel脑数据模拟12套含已知聚类的数据，并使用Tabula Muris、PBMC3k、Darmanis、Baron Pancreas、Brain Organoids、Tabula Sapiens等公开实验数据集，以调整兰德指数（Adjusted Rand Index，ARI）、归一化互信息（Normalized Mutual Information，NMI）及聚类误差（Clustering Error，CE）评估细胞与双聚类性能，并与Seurat、CAbiNet、RaceID、SC3、SIMLR、Monocle3、scDeepCluster、scG-cluster、BackSPIN、NMF等算法比较。

研究结果：

聚类细胞按方向（Clustering cells by direction）：CA将具相似表达谱的细胞与对应特征基因排列于从原点出发的同一方向上，距原点越远代表性越强。CAdir初始化若干方向，将细胞按到方向正交投影为正且正交距离最小分配给最近方向，以SVD求首主轴更新方向（总最小二乘），迭代至收敛；随后据方向间夹角做分裂与合并自动确定聚类数。Association Plot以投影距离为横轴（关联强度，association strength）、正交距离为纵轴展示各簇细胞（青绿色）与共聚类基因（橙色），理想簇细胞与基因均向右延伸且贴近x轴，可直观识别低质簇、离群细胞及跨簇相似度（通过他簇方向叠加显示夹角）。

Tabula Muris肢体肌（Tabula Muris Limb Muscle，LM）数据：对含1882细胞的TM LM数据，CAdir自动推断7个聚类且与金标准注释吻合；Association Plot显示T细胞等簇分离良好，未注释小簇亦呈明显方向性；叠加显示B细胞与巨噬细胞及T细胞方向夹角小（表达谱相似），内皮细胞与血管内皮细胞方向夹角小于其他类型，证实方向夹角可量化簇间相似性；算法分裂—合并过程树状图记录每步中间聚类状态及对应Association Plot，辅助理解聚类演变。

识别低质量聚类（Identifying low-quality clusters）：刻意在PBMC3k数据上设偏大初始k与偏小截断角诱发低质簇（Cluster 5仅20细胞，近原点无特异基因，无法注释），Association Plot中细胞与基因不向右延伸暴露其低质；S-score最高基因（如CDKN2A）提示为凋亡/离群细胞；去除S-score≤0的细胞基因后重聚类得其余5个合理簇且原Cluster 5残余细胞重分配至邻近生物学簇；自动细胞类型注释经基因集过代表征分析（Over-Representation Analysis，ORA）给出负log₁₀校正p值热图，Megakaryocyte与Platelet共享基因致次佳注释匹配参考文献标注，印证Association Plot形态与注释可信度关联；CAdir共聚类标记基因较scran::scoreMarkers更倾向簇特异性高表达而非广谱低水平差异基因。

基准测试（Benchmarking）：在12套Splatter模拟数据上CAdir最大ARI近1（与Seurat等相当），自动推断模式（CAdir_auto）性能不弱于固定角模式且显著优于RaceID_auto；平均ARI与NMI除略低于Seurat外优于多数对比算法，表明对参数鲁棒。在6套实验数据上CAdir属最佳算法之一，Darmanis等三套达最高ARI，大样本Brain Organoids与Tabula Sapiens可成功聚类（多数算法崩溃），60万细胞约30分钟完成，为测试算法中最快；Tirosh黑色素瘤数据中CAdir将CD4⁺与CD8⁺T细胞进一步分为两亚簇（标记基因为CD4、CD8A/CD8B、IL7R），虽降低与金标准ARI但仍具精细分辨力；Brain Organoids中CAdir合并发育连续梯度上的Cortical IP与Cortical Neuron（单方向），少识别一亚群分裂，总体符合参考注释趋势。

参数选择（Parameter choices）：保留CA维度数30–50（推荐默认50）可使ARI稳定；截断角分位数默认0.99在宽范围内对聚类数影响小且在多数数据最优，过高致过聚类；随机方向数默认100（最低20–50亦稳）可稳健估计截断角；分裂—合并迭代通常≤5轮收敛（默认最大50，方向变化阈值0.001°停止）；基因过滤保留距原点最远80%可排除管家基因且保簇特异性；Tabula Muris抽样验证CAdir推断聚类数至约20类与真实相符，超此受批次效应影响，需先去除批次效应。

双聚类基准测试（Biclustering benchmarking）：对模拟数据CAdir获最高最大与平均聚类误差（CE）及较高基因聚类ARI，优于CAbiNet、BackSPIN等双聚类算法，仅次于Seurat均值CE（Seurat需后验找标记基因）；高 dropout 稀疏数据下CAdir_auto仍为最佳双聚类算法，证明共聚类基因恢复能力强。

讨论与结论翻译：CAdir是一种可通过方向夹角自动推断聚类数、联合聚类细胞与基因的快速单细胞聚类算法，配套基于对应分析空间的Association Plot提供可解释聚类质量诊断与分裂—合并过程追踪图，规避了UMAP/t-SNE距离失真及事后标记基因检测的双重挖掘偏倚。CAdir在无用户提供聚类数的全自动模式下性能与指定参数模式相当，聚类方向与夹角还可量化细胞类型相似性辅助生物学解释。相较CAbiNet在大样本受内存限制，CAdir可扩至60万级细胞且耗时更短。CAdir共聚类基因多为已知细胞类型标记基因，支持基于基因集过代表征分析的自动注释。作为线性方法，CAdir在强非线性发育轨迹数据仍有竞争力，未来可考虑核方法拓展非线性簇形。综上所述，CAdir为scRNA-seq分析提供了快速、可解释、可自动推断聚类数的细胞—基因双聚类解决方案。R包发布于https://github.com/VingronLab/CAdir。