“喘息、哮喘及病毒对上皮结构与功能的影响”（WAVES）出生队列研究：旨在了解气道发育以及早期呼吸道病毒感染在儿童哮喘发病中的作用而设计的理论基础、研究方案与方法

《BMJ Open Respiratory Research》：The Wheezing, Asthma and Viral effects on the Epithelial Structure and function (WAVES) birth cohort study: rationale, design and methods to understand airway development and the role of early-life respiratory viral infections on childhood asthma inception

　　摘要
引言：在生命的第一年里，气道上皮屏障仍在不断发育，这一时期是儿童易受呼吸道病毒影响的关键阶段，而这些病毒可能诱发儿童哮喘。本研究旨在探讨呼吸道合胞病毒（RSV）感染对气道上皮的纵向发育、气道代谢、DNA甲基化以及后续儿童哮喘发展的影响。

方法与分析：WAVES出生队列研究是一项前瞻性观察性研究，从孕期开始招募母婴对，并跟踪儿童至5岁。该研究通过模拟婴儿期RSV感染的自然随机分布，记录婴儿首次RSV感染事件，并从出生到5岁定期进行鼻部采样，用于多组学分析及临床结局评估。WAVES研究计划招募250名孕妇及其子女（其中200名为高哮喘风险群体，50名为普通风险群体）。主要研究目标是揭示RSV感染如何通过影响气道上皮发育进而导致5岁时的哮喘发生。研究将采用纵向系统生物学方法，分析不同儿童在感染RSV后气道上皮的发育情况，尤其是那些最终发展为哮喘与未发展成哮喘的儿童。该方法能够整合单细胞和批量RNA测序数据、代谢组学数据以及表观遗传学数据，从而精确分析不同上皮细胞亚群的变化。

伦理与成果传播：本研究已获得范德比尔特大学医学中心IRB的批准（编号#222277），研究结果将通过同行评审期刊发表，并向研究参与者及普通公众通报。通过分析这些纵向多组学数据，我们希望揭示驱动气道上皮发育的关键机制，了解早期RSV感染如何改变这些过程，进而影响儿童期的呼吸系统疾病及哮喘发病风险。

现有研究进展：在生命的第一年里，气道上皮屏障处于动态发育状态，此时儿童对呼吸道病毒的易感性显著升高。在这一时期感染呼吸道病毒，如呼吸道合胞病毒，已被证实与儿童哮喘及其他气道疾病的发病密切相关。

本研究的贡献：通过识别出生时存在的气道上皮生长模式，以及这些模式在婴儿期如何因环境因素而发生变化，本研究将为理解外部因素（如RSV感染）如何影响气道发育过程提供新的见解。

对研究、实践或政策的潜在影响：了解气道上皮发育、环境暴露与早期易感期之间的相互作用，为制定针对急性及慢性呼吸系统疾病的干预措施奠定基础。确定关键的生物通路作为预防哮喘的治疗靶点，有助于优化临床及公共卫生策略，改善儿童气道健康状况。

引言：哮喘的起源与临床表现与气道上皮细胞的功能障碍密切相关。虽然免疫细胞在哮喘发病机制中也起着重要作用，但气道上皮才是呼吸道病毒感染的主要场所，许多已知的哮喘风险因素都是与气道上皮相互作用的因素。在生命的第一年里，气道上皮屏障仍在持续发育，这一时期是儿童易受呼吸道病毒影响的关键阶段，而这些病毒可能诱发儿童哮喘。

哮喘与其他复杂的健康问题一样，被认为是由多种外源性和内源性因素共同作用导致的，这些因素相互影响，决定了个体的易感程度。尽管部分儿童哮喘具有遗传性，但近年来哮喘患病率的上升以及不同国家及移民群体中哮喘发病率的显著差异，无法仅用遗传差异来解释。结合多项哮喘预防干预试验的结果，这些发现进一步强调了环境因素在哮喘发病及预防中的关键作用。

在我们的INSPIRE队列研究中，我们已经发现：(1) 早期呼吸道合胞病毒感染（并非仅严重感染）与非过敏性哮喘表型的形成有关，这类表型可解释相当比例的儿童哮喘病例；(2) 儿童早期就已存在气道上皮细胞相关的喘息表型，表现为鼻腔气道上皮细胞中基底细胞和分泌细胞的显著发育异常；(3) 早期RSV感染会对气道前体细胞中与哮喘相关的基因位点的DNA甲基化产生长期影响；(4) 2至3岁时出现反复喘息的儿童，其鼻腔气道上皮细胞的葡萄糖代谢存在异常，且表观遗传调控也发生了与婴儿期RSV感染相关的变化。我们的研究结果非常重要，因为它揭示了气道易感性的两个关键因素：发育重编程与早期RSV感染。此外，这些研究还揭示了呼吸道病毒感染引起的代谢和表观遗传变化与早期气道发育之间的内在联系。不过，目前这些研究中对鼻腔气道上皮细胞的评估最早是在2岁时进行的，缺乏感染前的样本，这是个局限性。

2020年，在美国国家过敏和传染病研究所的支持下，我们启动了WAVES研究，旨在扩展INSPIRE队列的研究成果，进一步了解早期RSV感染对气道上皮发育的影响，从出生开始长期追踪与哮喘表型相关的气道上皮发育特征，包括婴儿期RSV感染前后气道上皮细胞的情况。

我们开展这项研究的动机源于自身及其他人的研究发现，这些发现使我们提出以下假设：(1) 出生时已存在不同类型的气道上皮发育表型，它们在塑造特定哮喘表型中起关键作用；(2) 这些气道表型对婴儿期环境因素（如RSV感染）有独特的反应，进而促进哮喘的发展。发育、代谢和表观遗传机制会引发异常的气道屏障变化及早期气道上皮发育，这些都是病毒反应及哮喘发病过程中的重要环节。

为验证这些假设，我们设计了WAVES这项出生队列研究，旨在评估RSV感染对气道上皮的纵向发育、气道代谢、基因表达、DNA甲基化以及后续儿童哮喘发展的影响。通过综合分析方法，我们希望识别出具有临床意义的鼻黏膜表型、发育路径、代谢变化及表观遗传改变，从而明确正常气道上皮细胞与哮喘相关气道上皮细胞的生物学特性及发育规律，同时了解呼吸道病毒如何改变气道上皮发育，为后续的预防和治疗提供依据，具体见图1。

图1：研究设计、策略及预期结果的示意图。AGE：晚期糖基化终产物；GDP：鸟苷二磷酸；mo：月；NAEC：鼻腔气道上皮细胞；OXPHOS：氧化磷酸化；RNA-seq：RNA测序；ROS：活性氧物种；RSV：呼吸道合胞病毒；scRNA-seq：单细胞RNA测序；TCA：三羧酸循环；UDP-GABA：尿苷二磷酸-γ-氨基丁酸；yr：年；yrs：年数。

WAVES研究的目标包括：(1) 利用单细胞RNA测序和批量RNA测序技术，分析气道黏膜的纵向生物学分化路径，明确出生时存在的发育差异及其与后续喘息和哮喘风险的关联，同时探讨不同哮喘表型是否会导致不同的发育特征；(2) 识别婴儿期气道上皮细胞代谢的纵向变化，这些变化发生在哮喘表型出现之前，同时确定哪些代谢路径受到RSV感染的影响，进而区分不同的哮喘表型及表型类型；(3) 明确早期RSV感染对气道上皮DNA甲基化的影响及其与后续儿童哮喘发病的关联。

WAVES研究的指导原则是聚焦具有临床意义的研究内容，该出生队列研究正是为填补我们对儿童哮喘发育机制、遗传因素、代谢因素及早期呼吸道病毒感染作用的理解空白而设计的，期望通过这些研究揭示哮喘的发育异质性，从而为寻找预防和治疗的生物靶点提供依据。

方法与分析：研究设计及目标人群：WAVES是一项前瞻性观察性妊娠队列研究，从孕期开始招募母婴对，并跟踪儿童至5岁。该研究通过主动和被动监测手段，精准识别婴儿首次RSV感染事件，并每年进行随访以评估临床结局。WAVES研究计划招募250名孕妇及其子女（200名为高哮喘风险群体，50名为普通风险群体）。高风险群体包括父母一方或双方、或兄弟姐妹患有哮喘和/或过敏性鼻炎的儿童；普通风险群体则指父母均无哮喘或过敏性鼻炎的儿童。研究对象为在范德比尔特大学医学中心或其附属机构接受产科护理、且计划在该中心分娩的孕妇。该研究中心所在的中田纳西地区涵盖了多种种族和民族，包括白人（62.5%）、黑人（27.7%）、其他种族（0.1%）以及各种族的西班牙裔（22.2%），研究区域涵盖城市、郊区和农村社区。为确保研究设计的科学性，我们还开展了患者和公众参与计划，通过反馈会、研究通讯以及以往出生队列研究中的参与者反馈来不断完善研究设计。

WAVES研究遵循流行病学观察性研究报告强化标准（STROBE）中的队列研究指南（见在线补充表1）。

伦理与安全：该研究已获得范德比尔特大学医学中心IRB的伦理批准（编号#222277），每位儿童的生母都签署了书面知情同意书。虽然这是一项观察性研究，但我们仍制定了数据安全与监测计划，由一名不参与研究的独立医疗安全官员负责监督。WAVES研究同意书可在以下网址获取：https://medsites.vumc.org/centerforasthmaresearch/waves-study。

纳入标准：符合条件的参与者为在我们的学术医疗中心附属机构接受产前护理、且计划在本中心分娩的健康孕妇。具体纳入与排除标准见在线补充表2。

研究概述：WAVES研究的入组时间为孕期，包括一次孕检和一次分娩后的随访。儿童则需在出生时、2个月、4个月、6个月、12个月、18个月、24个月、36个月、48个月和60个月时接受随访。研究人员会每年使用国际儿童哮喘和过敏研究问卷——一种经过验证的标准哮喘及过敏疾病评估工具——来检测儿童的喘息和哮喘状况。在RSV高发季节，儿童在生命的第一年内会每两周接受一次主动和被动监测。RSV的检测通过聚合酶链反应实现，1岁时还会进行RSV血清学检测；对于无法通过PCR或RNA测序确定的感染年龄，则通过统计建模来推断。研究还采用客观的有序呼吸严重程度评分来评估呼吸系统疾病的严重程度。在所有时间点，都会进行鼻部采样，用于鼻腔气道上皮细胞培养、批量RNA测序，以及使用10× Chromium Single Cell Gene Expression Flex技术保存鼻腔气道上皮细胞样本，以便在出生时、4个月、12个月和24个月时进行高质量的单细胞分析，同时尽量减少批次效应。5岁时还会进行特异性IgE检测和皮肤测试。图2展示了该研究的各项组成部分的纵向结构。

图2：WAVES出生队列的研究时间点、检测项目及临床结局。PMBC：外周血单核细胞；RSV：呼吸道合胞病毒。

随访安排：各项随访的具体内容详见在线补充文件1。关于各时间点样本采集的详细信息，请参考图2和在线补充表3。为减轻参与者的负担，随访时间通常安排在常规产科和儿科检查期间进行。在生命第一年的每次计划访问中，指定的访问时间窗口为±60天，两次访问之间至少间隔28天。一次访问也可以拆分为多次前往研究机构或家中的访问，或者结合电话沟通与面对面交流进行。此外，从RSV季节开始，即根据田纳西州中部的病毒监测数据确定的RSV流行期起，直至15个月大时，都会进行每两周一次的RSV监测以及患病情况随访，具体细节见在线补充文件1。

生物样本采集：部分样本需亲自采集，而另一些则由护理人员在家中使用远程采集工具收集，然后再送回研究地点。关于鼻腔生物样本采集的详细信息如下。

调查问卷：虽然可以在面对面研究访问期间填写调查问卷，但大多数参与者更愿意通过安全的Research Electronic Data Capture（REDCap）网络平台在家中完成回答。必要时也会提供问卷的纸质副本或REDCap调查链接。

定期鼻腔样本采集：从生物学母亲以及婴儿出生后开始，会定期采集鼻腔样本，用于NAEC培养、scRNA-seq保存、批量RNA-seq分析、NAEC代谢组学研究、DNA甲基化检测以及微生物组分析。这些内容的详细信息见在线补充文件1。

血液样本：出生时会采集脐带血，而在1岁、2岁、3岁和5岁时分别采集儿童血液样本。计划的分析项目包括RSV血清学检测、绝对嗜酸性粒细胞计数、过敏原特异性IgE检测，以及针对鼻腔、血液或唾液样本的基因组分析。

正常气道上皮细胞研究结果：我们预先提出了三项研究目标，旨在了解气道上皮细胞的发育过程以及婴儿RSV感染对其的影响：(1) 对发育中的气道上皮细胞进行全面的纵向分析，确定与哮喘及婴儿RSV感染状况相关的发育轨迹和表型类型；(2) 明确婴儿气道上皮细胞代谢在儿童期哮喘发病前的纵向变化，同时考虑RSV感染状况的影响；(3) 通过识别纵向鼻腔气道上皮细胞样本中差异性甲基化的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤位点，确定婴儿RSV感染对气道上皮细胞DNA甲基化的影响，进而评估其后续患哮喘的风险。

临床研究结果：WAVES出生队列中临床结果的定义见表1。

表1：儿童呼吸系统疾病的定义

协变量评估：作为统计分析中的协变量，可能存在的混杂因素数据将通过详细的家长问卷或在整个研究过程中持续进行的身体测量来获取。儿童相关的协变量包括出生体重、胎龄、性别、种族与民族、体重指数百分位数、婴儿期其他呼吸道病毒感染情况、是否上托儿所、是否有兄弟姐妹、是否接触二手烟、是否母乳喂养、是否使用过抗生素（包括在鼻腔采样时）、健康保险状况以及是否有宠物。母亲方面的协变量包括与妊娠相关的疾病（如妊娠糖尿病、先兆子痫和妊娠期体重增长）、慢性疾病（如哮喘、糖尿病、肥胖症和过敏性鼻炎），以及人口统计学变量（如教育程度、住房条件与就业状况），还有通过地址地理编码得到的社会经济地位潜在变量。在研究期间，母亲是否接种过RSV疫苗以及婴儿是否接受过RSV免疫预防措施，也会通过报告和电子健康记录来记录。

研究效能：我们通过scRNA-seq实验获得的初步结果显示，该方法在描述细胞分化特征及识别相关差异基因谱方面具有较高的灵敏度。在WAVES高风险队列中，我们预计有35%的儿童会患上哮喘（其中60名儿童患有哮喘，允许15%的脱落率；153名儿童未患哮喘，也允许15%的脱落率）；在这些患哮喘的儿童中，一半为非过敏性哮喘，另一半为过敏性哮喘。因此，WAVES队列中哮喘的患病率与我们及其他已建立的儿科队列的数值一致，这为开展这些研究提供了充足的样本数量。RSV感染是一种天然的准随机暴露因素，因为与其他呼吸道病毒不同，我们和其他研究者已经证明，在生命的第一年内，大约一半的婴儿会感染RSV，而另一半则不会。在我们的批量RNA-seq研究中，我们将分析来自810个样本的转录组数据，这些样本涵盖了不同的时间点，其中包括用于scRNA-seq分析的样本。通过RnaSeqSampleSize工具，并考虑到样本量在5到20之间的不同情况，效能分析显示：如果使用5个样本进行scRNA-seq分析，那么在基因表达差异至少为三倍、假发现率仅为5%、基于我们初步的批量RNA-seq数据得出的最大离散度为1e-4、且每个基因的平均读取次数为10次的情况下，我们拥有超过90%的效能来检测相关基因。如果我们按照计划使用15个样本，那么在假发现率为5%、最大离散度为1e-4、每个基因的平均读取次数为10次的前提下，我们拥有超过99%的效能来检测基因表达差异至少为两倍的基因。一般风险组中的参与者并未纳入效能计算中，他们被纳入研究是为了在描述性分析中与高风险组中父母患有哮喘的儿童进行比较，从而评估其基线特征和发育状况。在所有包含他们的分析中，我们都会对父母的哮喘风险状况进行调整。

在复杂的人类单细胞基因组研究中，评估统计效能的方法仍在不断发展，且面临诸多挑战，因为细胞频率、细胞群体内基因表达水平的细胞间差异以及读取深度/细胞数量都会影响分析效能。为了解决这些已知问题，并确保能够对细胞频率不稳定的上皮细胞亚群数据进行稳健分析，我们将采用scRNA-seq数据的伪批量处理方法，这一方法也与我们及其他人近期发表的最佳实践一致。我们的整合数据集将包含来自120多名个体的约120万个细胞的转录组数据，这意味着即使对于频率低至1%的稀有细胞亚群，平均每个受试者体内也有超过100个这样的细胞。我们之前发布的关于儿童上皮样本中基底细胞和前体细胞亚群的数据表明，采用伪批量处理策略（即在对数变换后的计数总和数据上进行DESeq2分析），其分析效能与上述批量RNA-seq研究所得的效能相当。如果每组/每个时间点有10名受试者（即过敏性哮喘组与对照组），那么我们在假发现率低于0.05的情况下，拥有至少80%的效能来检测出logFC值大于0.5、具有细胞类型特异性的差异表达基因。

分析：鼻腔采样类型、生物样本处理流程及分析方法的概要见图3。对于WAVES队列的儿童，我们将在出生时以及4个月、12个月和24个月大时，对相同的鼻腔刷样本进行scRNA-seq分析；而在出生时以及2个月、4个月、6个月、12个月、18个月、24个月、36个月和48个月大时，则进行批量RNA-seq分析。选择这些时间点是基于我们的初步研究结果，该结果表明上皮细胞的发育存在显著的年龄相关性变化，且患有反复喘息的儿童与从未有过喘息症状的儿童（对照组）之间存在差异。scRNA-seq分析方法将帮助我们识别由于发育过程导致的不同上皮细胞亚群之间的显著差异，以及不同哮喘表型之间的差异。scRNA-seq获得的鼻腔刷样本数据将作为参考数据集，用于解析批量RNA-seq数据中的信息。通过这一过程得到的细胞类型比例估计值，再结合CellDMC统计框架，将用于推断整个幼儿期发育过程中气道上皮细胞中具有细胞类型特异性的信号变化（涵盖0个月、2个月、4个月、6个月以及1岁、1.5岁、2岁、3岁和4岁的不同年龄阶段）。之后，我们计划通过富集分析来确定基因组的维度，将每组感兴趣的基因表达简化为一个单一变量，该变量可反映该基因组在相应通路中的标准化表达水平。通过追踪这些变量随时间的变化，我们可以重建出具有生物学意义的事件发展轨迹。为此，我们将使用纵向线性组合检验方法来进行基因组分析：首先，利用功能线性回归模型分析受试者内部在已识别的发育轨迹和表型变量方面的差异，其中轨迹变量被视为在非线性时间域内定义的功能响应，同时还会纳入潜在的时变协变量；其次，通过线性组合检验来识别与由轨迹和表型变量所表征的纵向事件相关的具有显著作用的基因组和协变量。我们还将考虑使用混合效应回归建模方法（如lme4和nlme），这类方法能够灵活地处理时间因素、协变量以及重复测量数据。这一策略可为健康儿童与哮喘患儿之间的发育轨迹差异提供严格的统计显著性检验。为了解决全基因组分析以及其他高维分析（如RNA-seq、scRNA-seq和DNA甲基化分析）中的多重检验问题，我们将控制假发现率，例如采用Benjamini–Hochberg方法。

图3：鼻腔样本采集、处理及数据分析的流程图。NAECs：鼻腔气道上皮细胞；scRNA-seq：单细胞RNA测序；RNA-seq：RNA测序。

偏差来源及缓解措施：我们设计了一项前瞻性队列研究，即在结果出现之前就收集暴露相关信息，这是一种减少回忆偏差的标准方法。研究中的纳入标准和排除标准都有明确规定，而且暴露因素和结果数据都是以客观的方式收集、定义并处理的。为降低选择偏差，所有具备暴露因素和结果数据的相关合格参与者都将被纳入研究；如果某些协变量存在非随机缺失的情况，我们将进行数据填补；同时还会进行敏感性分析，以评估数据缺失以及暴露因素可能被错误分类所带来的影响。我们会通过严格的保留策略将样本流失率控制在最低水平，同时会对那些失去随访联系的参与者与仍留在研究中的参与者进行特征对比，以评估可能产生的影响。

混杂偏差：在统计分析中，我们将使用多变量逻辑回归模型来控制潜在的协变量（如年龄和性别），以此评估各种因素之间的关联。我们还会对变量间的多重共线性情况进行评估，以便降低数据维度并确保模型的稳定性。在适当的情况下，我们也会考虑加入交互项。此外，为了纠正系统中存在的、未被观察到的批次或人群差异带来的混杂影响，我们还将运用本团队开发的潜在因子校正方法，该方法已在我们之前关于气道上皮细胞分子特征的研究中得到应用并验证。

内部验证：在进一步的统计分析中，我们将通过对原始样本数据集进行交叉验证来确认研究结果，例如，以此确定无偏的发育轨迹模式与喘息症状及RSV感染结果之间的关联；我们还将采用蒙特卡洛模拟方法来预测模型输出结果，并计算信噪比。

外部及细胞组成验证：作为美国国立卫生研究院儿童过敏与哮喘数据存储库（CADRE）中专注于哮喘和过敏性疾病研究的出生队列数据存储库的一部分，我们获得了使用其他CADRE队列的批量RNA-seq数据来进行验证的许可（网址：https://cadre.med.wisc.edu/）。我们还将选取一部分批量RNA-seq样本，在通过分析确定的发育过程中的某个关键时间点进行交叉验证。

功能验证：我们将通过测量分化后的肺泡上皮细胞的各种屏障功能（如通透性、连接结构、纤毛功能以及黏液分泌功能）作为随时间变化的终点指标。对于关键基因标记物和相关信号通路，我们则将通过qPCR技术和成像技术，在气液界面处进行验证。而对于代谢组学分析的功能验证，我们则将采用靶向同位素示踪技术（通量测定法）以及Biolog公司的代谢分析试剂盒。

伦理与数据传播：这项观察性纵向研究已获得范德比尔特大学医学中心伦理委员会的批准。研究结果将通过经过同行评审的科学期刊发表，同时也会向研究参与者及公众公开。数据共享方面，我们将按照美国国立卫生研究院的要求，将去标识化的多组学数据存储在公共数据存储库中，例如NIAID ImmPort和dbGaP（基因型与表型数据库）。ImmPort和dbGaP都是由美国国立卫生研究院资助建立的数据存储平台。我们将把免疫学相关数据存储在专为免疫学研究数据设计的NIAID ImmPort平台中，而基因组数据则存储在dbGaP数据库中。

总结：我们采用了全面且跨学科的研究方法，汇集了一批拥有不同专业背景的科研人员，这项研究将为揭示哮喘在生命早期形成的生物学机制提供重要见解，它将以前所未有的精确度识别出不同的气道表型类型以及生命早期呼吸道病毒感染在其中所扮演的角色。该研究方案具有四个关键的创新点，有望推动相关领域的发展：（1）采用独特的系统生物学方法，从出生开始对气道上皮细胞亚型进行纵向研究，以揭示哮喘的异质性；（2）研究目标具有创新性且意义重大，旨在阐明正常气道与哮喘气道的发育过程，以及早期呼吸道病毒感染的影响；（3）为科学界建立独特的气道上皮细胞共享资源与数据平台；（4）有望针对从出生开始的气道生物学特征，开发出具有临床意义的哮喘预防和治疗方法。WAVES研究的主要成果包括：（1）识别不同细胞类型在早期RSV感染下的上皮分化缺陷及其功能脆弱性；（2）明确关键发育过程的时机问题；（3）确定易受表观遗传重编程影响的细胞类型、发育窗口及生物通路；（4）找出调控上皮发育的代谢物；（5）阐明早期呼吸道病毒感染对发育进程的影响；（6）确定会提高上皮屏障敏感性的具体产后时段；（7）分析RSV引发的表观遗传改变、其持久性及其与儿童哮喘表型的关联。这些发现将改变我们对哮喘发病机制的理解，并为基于生物学特征的预防和治疗措施奠定基础。我们通过先进的纵向整合技术，结合单细胞数据、基因表达数据、代谢组学数据和表观遗传学数据，并以上皮细胞亚型为分析单元，这是一种理解健康状态及不同哮喘表型下气道上皮复杂且异质性发育过程的必要系统生物学方法，有助于明确常见的早期哮喘风险因素——RSV感染对气道上皮发育的影响。我们的WAVES出生队列从出生开始会对气道进行以下独特的纵向且频繁的检测：（1）使用10X Genomics Flex技术进行细胞保存，以便开展单细胞分析；（2）通过细胞培养研究代谢功能及体外感染情况；（3）在培养环境中检测从基底上皮到特化上皮的分化过程，以了解相关的发育通路。我们将把代谢研究结果与其他上皮“组学”数据相结合，在产后发育阶段构建完整的机制性系统生物学框架，从而全面理解发育过程中的重编程现象（见图3）。这项创新的纵向研究旨在通过多维度视角探讨从出生开始的气道上皮屏障的发育过程。通过这一研究，我们可以识别出生时已存在的气道上皮变化，以及从上皮细胞亚型角度分析哮喘的发育易感性，明确在过敏性和非过敏性哮喘表型出现之前，正常与异常的气道上皮产后分化轨迹，以及常见环境风险因素RSV感染的影响。这种整合性的研究方法对于揭示儿童哮喘的发育起源至关重要。我们将创建并分享新的多组学参考模型，用于高效重建新生儿期气道上皮的发育轨迹。这将为科学界提供宝贵的数据资源，尤其有助于在大规模呼吸道疾病队列研究中分析上皮细胞的发育重编程现象。目前，针对大多数哮喘患儿而言，有效的初级预防措施极为有限，也缺乏基于哮喘气道上皮发育生物学特征的针对性治疗手段。通过明确驱动过敏性、非过敏性及正常气道上皮发育的时机与通路，以及早期感染的作用，我们有望找到新的预防和治疗方法，从而调控早期气道上皮的正常发育。