TGFβ信号维持小鼠齿状回Sox4+星形胶质细胞祖细胞并限制BLBP+星形胶质细胞的早期分化

《Frontiers in Cellular Neuroscience》：TGFβ signalling maintains Sox4+ astrocyte progenitors and restricts the early differentiation of BLBP+ astrocytes in the mouse dentate gyrus

　　

摘要：小鼠海马齿状回（dentate gyrus, DG）中的星形胶质细胞至少部分来源于脑脂肪酸结合蛋白（brain-type fatty acid-binding protein, BLBP/Fabp7）+细胞，但控制其分化启动的机制尚不清楚。为此，研究人员首先利用Ki67及周期蛋白依赖性激酶抑制剂p57表征了BLBP+细胞的发育动态。Ki67+/BLBP+增殖祖细胞在出生后第1天（P1）达峰值，于P3–P6下降，此时p57+/BLBP+早期分化星形胶质细胞开始累积。这一时序转换促使研究人员探究何种机制维持增殖池并限制过早分化。研究人员鉴定出TGFβ信号的下游转录因子Sox4是发育中DG未分化星形胶质细胞谱系的特异性标记。在胚胎期E15–E17，Sox4与BLBP及磷酸化波形蛋白（phosphorylated vimentin, pVimentin/pVim）共表达于基底放射状胶质细胞（basal radial glia, bRG）；在P1–P6，Sox4与BLBP、Sox3及Ki67共表达于包括近期鉴定的Olig2+/BLBP+星形胶质细胞祖细胞（astrocyte progenitors, ASPs）在内的增殖胶质祖细胞。Sox4标记ASPs但不标记NeuroD+神经元祖细胞或p57+/BLBP+早期分化星形胶质细胞。自P14起，Sox4持续表达于颗粒下区（subgranular zone, SGZ）部分BLBP+放射状胶质样细胞（radial glia-like cells, RGLs）及分子层BLBP+细胞。综上，Sox4特异性标记BLBP+胶质祖细胞（bRG、RGLs及ASPs）而非其分化后代。与胶质瘤起始细胞中描述的自分泌TGFβ1–Sox4通路一致，TGFβ1与BLBP在bRG、RGLs及ASPs中共表达。在DG组织块培养中用SB431542阻断TGFβ信号后，Sox4+祖细胞耗竭，p57+/BLBP+星形胶质细胞异常累积。结果表明，TGFβ信号通过维持Sox4+祖细胞，从而限制小鼠DG中BLBP+星形胶质细胞的早期分化。

论文解读：TGFβ信号维持小鼠齿状回Sox4⁺星形胶质细胞祖细胞并限制BLBP⁺星形胶质细胞的早期分化

一、研究背景与意义

传统观点认为GFAP（glial fibrillary acidic protein）⁺细胞代表全部星形胶质细胞，但单细胞转录组学揭示星形胶质细胞具有高度异质性，存在GFAP^?/Crym⁺/S100β⁺等不同亚型。小鼠齿状回（dentate gyrus, DG）部分星形胶质细胞来源于脑脂肪酸结合蛋白（brain-type fatty acid-binding protein, BLBP/Fabp7）⁺细胞，且近期鉴定出Olig2⁺/BLBP⁺星形胶质细胞祖细胞（astrocyte progenitors, ASPs），该类细胞多为GFAP阴性。然而，BLBP⁺星形胶质细胞何时及如何由增殖向分化转换仍不清楚。转化生长因子β（transforming growth factor beta, TGFβ）信号是神经干细胞/祖细胞池维持的关键调节因子，其下游效应分子pSmad3在DG发育期的bRG（basal radial glia）和RGLs（radial glia-like cells, 放射状胶质样细胞）中表达；在胶质瘤起始细胞中，自分泌TGFβ1通过诱导Sox4（SRY-box transcription factor 4）维持肿瘤发生能力。这提示TGFβ–Sox4轴可能参与正常DG中BLBP⁺胶质祖细胞的未分化状态维持。本文发表在《Frontiers in Cellular Neuroscience》，旨在阐明BLBP⁺星形胶质细胞谱系的分化时序及TGFβ–Sox4通路对其祖细胞维持与分化限制的调控作用。

二、主要关键技术方法

研究人员选用C57BL6/Ncrl小鼠及gfap-GFP转基因小鼠（胚胎期E14.5–E18.5及出生后P1–P21），进行脑组织冰冻切片制备；采用免疫荧光多重标记（immunofluorescent labelling）结合激光共聚焦显微镜成像及Fiji软件定量；取P0海马进行DG组织块外植体培养（explant culture），分别用TGFβⅠ型受体抑制剂SB431542或DMSO对照处理6天或12天，后进行免疫荧光检测；两组间比较采用双尾Student's t检验（GraphPad Prism）。

三、研究结果

BLBP⁺cells in the developing mouse DG undergo a temporal switch from a Ki67⁺proliferative state to a p57⁺early-differentiated state

研究人员用增殖标记Ki67和细胞周期退出/早期分化标记p57检测BLBP⁺细胞发育动态。结果显示BLBP⁺细胞在E18–P3增加，P6后减少；Ki67⁺/BLBP⁺双阳细胞P1达峰（占BLBP⁺细胞42.8%±7.7%），P3–P6骤降；p57⁺/BLBP⁺双阳细胞P3起显著升高（P3为62.5%±4.2%，P6为75.7%±6.0%）。结论：BLBP⁺谱系在P1以Ki67⁺增殖祖细胞为主，P3–P6转换为p57⁺早期分化星形胶质细胞，存在明确的增殖—分化时序转换。

Sox4 is co-expressed with BLBP and pVimentin in basal radial glia of the embryonic DG

为寻找增殖BLBP⁺群体特异性转录因子，研究人员检测Sox4表达。E15 Sox4围绕齿状切迹（dentate notch, DN）与BLBP共定位；E17 Sox4呈核内信号与BLBP⁺细胞共表达，并与有丝分裂标记磷酸化波形蛋白（phosphorylated vimentin, pVim）共标于分裂中bRG。结论：Sox4在胚胎DG的增殖性bRG（BLBP⁺/pVim⁺）中表达，提示其为未分化胶质祖细胞标记。

pSmad3 is expressed in pVim⁺/BLBP⁺bRG, and pVim⁺cells co-express Sox2 and Sox3 in the developing DG

研究人员验证TGFβ通路效应分子pSmad3在胚胎bRG中表达——E16 pSmad3与pVim及BLBP共标于有丝分裂bRG；E17 BLBP⁺细胞共表达Sox2和Sox3；P1分子层和海马残（hilus）中pVim⁺细胞共表达Sox2/Sox3。结论：TGFβ效应分子pSmad3与Sox4共同在BLBP⁺/pVim⁺bRG中表达，支持TGFβ–Sox4轴在此群体运作的可能。

Sox4 selectively marks Olig2⁺/BLBP⁺astrocyte progenitors and BLBP⁺RGLs in the postnatal and adult DG

研究人员检测生后及成年DG中Sox4谱系特异性。P1 Sox4与星形胶质细胞谱系标记Sox9共标，但不与神经元祖细胞标记NeuroD共标；P1–P3部分BLBP⁺细胞Sox4⁺（P1: 47.4%±9.2%；P3: 23.4%±3.6%），其中Sox4与Olig2在BLBP⁺区域共表达，确认Sox4⁺/Olig2⁺/BLBP⁺为ASPs；P14及P60 Sox4持续标记SGZ处BLBP⁺RGLs及分子层BLBP⁺星形胶质细胞（P14: 1.4%±0.3%）。Sox4不出现于p57⁺/BLBP⁺分化星形胶质细胞。结论：Sox4选择性标记DG中BLBP⁺胶质祖细胞连续谱系（胚胎bRG→生后Olig2⁺/BLBP⁺ASPs→成年SGZ RGLs），排除分化后代及神经元谱系。

TGFβ signalling maintains Sox4⁺progenitors and restricts the early differentiation of BLBP⁺astrocytes

研究人员检测TGFβ1在BLBP⁺祖细胞中E17、P3、P14及P21均共表达，提示自分泌/旁分泌作用。DG外植体用SB431542处理6天后，Sox4⁺细胞（DMSO 37.0%±6.7% vs SB431542 0.4%±0.1%, p<0.0001）及Sox4⁺/BLBP⁺双阳细胞几乎消失，Sox2⁺细胞亦减少；反之p57⁺细胞（3.9%±0.8% vs 52.4%±5.5%, p=0.0025）及p57⁺/BLBP⁺双阳细胞（2.7%±0.9% vs 26.0%±2.4%, p<0.0001）显著增加；培养12天后BLBP⁺细胞比例剧增（1.1%±0.1% vs 56.0%±2.8%, p<0.0001）。结论：TGFβ信号通过维持Sox4⁺祖细胞池限制BLBP⁺星形胶质细胞早期分化；阻断TGFβ促祖细胞耗竭并加速分化为p57⁺/BLBP⁺星形胶质细胞。

四、讨论与结论总结

研究人员在讨论中指出，本研究首次在正常人海马发育中证实胶质瘤起始细胞里描述的TGFβ–Sox4自分泌环路同样存在于BLBP⁺DG祖细胞，控制其分化时机。TGFβ1由BLBP⁺/Sox4⁺祖细胞自身表达，支持自分泌模式。Sox4可能通过类上皮–间质转化（epithelial–mesenchymal transition, EMT）程序及与Notch信号交互（pSmad3–Notch intracellular domain共激活）维持祖细胞属性，并可能通过诱导Hes5抑制少突胶质细胞分化而偏向星形胶质细胞命运。BLBP⁺ASPs大多GFAP阴性，说明BLBP⁺与GFAP⁺星形胶质细胞谱系不完全重叠，BLBP可能标记发育状态而非稳定亚型，需Sox4⁺或BLBP⁺谱系示踪进一步验证。p57在P3–P6 BLBP⁺细胞中累积标志分化启动，除促细胞周期退出外还可能抑制Mash1/Ascl1强化星形胶质细胞命运。TGFβ（维持祖细胞）与BMP（促进GFAP⁺星形胶质细胞分化）可能拮抗平衡。

最终结论（翻译自Discussion末段）： 本研究发现小鼠DG中BLBP⁺星形胶质细胞谱系存在从P1 Ki67⁺增殖祖细胞向P3–P6 p57⁺早期分化星形胶质细胞的时序转换；转录因子Sox4特异性标记该谱系各阶段未分化BLBP⁺胶质祖细胞（bRG、Olig2⁺/BLBP⁺ASPs及成年SGZ RGLs），不标记分化后代；TGFβ1与Sox4⁺/BLBP⁺祖细胞共表达，药理阻断TGFβ信号耗竭Sox4⁺祖细胞并促进p57⁺/BLBP⁺星形胶质细胞提前分化。因此，TGFβ1–Sox4通路是发育中小鼠DG维持BLBP⁺胶质祖细胞并限制其早期星形胶质细胞分化的关键调节机制。